本文(wén)為(wèi)系列文(wén)章《大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析概论》的第十四篇，旨在根据已发表的文(wén)献资料，初步的介绍定量分(fēn)析双特异性抗體(tǐ)的LBA方法所面临的挑战。 由于内容篇幅较長(cháng)，本文(wén)将采取上下篇形式进行推送，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州博济医药微信公众号打造的科(kē)普學(xué)术专栏，内容均為(wèi)博济医药药物(wù)研究中心资深科(kē)學(xué)顾问袁智博士原创。 与传统（单特异性）的生物(wù)药相比，双特异性生物(wù)药对其药代动力學(xué)（PK）的表征提出了独特的挑战。在此背景下，开发生物(wù)药的生物(wù)分(fēn)析策略正在迅速演变，以支持这些不断变化的药物(wù)模式。 一般说来，生物(wù)分(fēn)析策略应根据药物(wù)的作用(yòng)机制（mechanism of action，MOA）和开发阶段定制。对于 mAb 药物(wù)，用(yòng)于分(fēn)析药代/毒代动力學(xué)（PK/TK），药效动力學(xué)和免疫原性的分(fēn)析方法通常分(fēn)别為(wèi)定量分(fēn)析、“游离”和“总”药物(wù)浓度、“游离”和“总”靶标浓度、抗药物(wù)抗體(tǐ)（ADAs）和中和性 ADAs的开发和验证。对于具有(yǒu)复杂结构的抗體(tǐ)衍生物(wù)（antibody derivatives），衍生物(wù)的每个功能(néng)域可(kě)能(néng)需要额外的一组检测方法，从而可(kě)能(néng)导致测试方法的数量几何级增長(cháng)。 此外，与开发默认没有(yǒu)生物(wù)转化（biotransformation）的mAb相比，复杂的抗體(tǐ)衍生物(wù)更容易发生生物(wù)转化，这意味着可(kě)能(néng)需要另一组测试方法来描述复杂抗體(tǐ)药物(wù)的结构完整性及其生物(wù)转化后的各种产物(wù)（biotransformed variants）。 配體(tǐ)结合式测试方法（LBA）是mAbs生物(wù)分(fēn)析的主力军，同时液相色谱-质谱方法（LC-MS）也在近年越来越受欢迎。这两种分(fēn)析技术也主要应用(yòng)于抗體(tǐ)药物(wù)及其衍生物(wù)的生物(wù)分(fēn)析。 由于药物(wù)模式的复杂性，通常需要多(duō)个 LBA/LC-MS 分(fēn)析方法。当每个分(fēn)析方法都有(yǒu)特定的取样程序，而且并非所有(yǒu)的检测可(kě)以在一个生物(wù)分(fēn)析实验室实施时，独特的样本采集、处理(lǐ)、储存、运输和分(fēn)析条件，会造成复杂的后勤需求。因此，需要设计一种生物(wù)分(fēn)析策略，用(yòng)于表征双特异性分(fēn)子的PK特性，并研究其體(tǐ)内结构-功能(néng)关系。本文(wén)提供了若干相关案例研究和监管层面的预测。导论 近年来，蛋白质工程和生产方面的进展推动着生物(wù)制药行业开发越来越复杂的蛋白质药物(wù)，其能(néng)够结合多(duō)个药物(wù)治疗靶标，故能(néng)够提高疗效和/或者减少剂量，用(yòng)以降低毒性，使安全风险最小(xiǎo)化，提高用(yòng)药的方便性和依从性等。双特异性药物(wù)被定义為(wèi)基于抗體(tǐ)（antibody-based）或基于框架（scaffold-based）的蛋白质药物(wù)，其包含一个以上的工程改造功能(néng)區(qū)域，该功能(néng)區(qū)域结合两个或多(duō)个独立的抗原靶点。本文(wén)集中关注双特异性药物(wù)的两个独特的功能(néng)域，其结合与疾病的发生和进展相关的蛋白质，而不考虑抗體(tǐ)骨（主）干（antibody backbone）的功能(néng)。 开发双特异性生物(wù)药的领域，基于并发展了传统的单分(fēn)子靶点的抗體(tǐ)免疫疗法的框架，正在蓬勃发展，以靶向协同的分(fēn)子途径（target synergistic molecular pathways）来更有(yǒu)效地治疗疾病。两种双特异性抗體(tǐ)，blinatumomab（Blincyto）和catumaxomab（Removab）已经在美國(guó)或欧盟批准上市，用(yòng)于肿瘤适应症的治疗；这证明了这类药物(wù)分(fēn)子的应用(yòng)价值。目前有(yǒu)60多(duō)种用(yòng)于癌症和其它疾病的新(xīn)型双特异性生物(wù)药正在临床开发之中。双特异性生物(wù)药分(fēn)子 双特异性分(fēn)子可(kě)以以各种不同的结构呈现，利用(yòng)抗體(tǐ)可(kě)用(yòng)的各种结合域。这些结合域包括可(kě)变重链(VH)、可(kě)变轻链(VL)、单链分(fēn)子(ScFv)和/或抗體(tǐ)的Fc域，可(kě)以组合使用(yòng)这些结构域，以结合多(duō)个分(fēn)子靶标。具有(yǒu)多(duō)个Fab结合域的双可(kě)变域免疫球蛋白(dual-variable domain immunoglobulin，DVD -Ig)这样的大型免疫球蛋白分(fēn)子和较小(xiǎo)的串联ScFv结构域(diabody)，在分(fēn)子大小(xiǎo)和结构上代表了两个极端，它们都可(kě)通过各种蛋白质工程技术生产出来(图1)。 图1. 双特异性分(fēn)子的构造。本图展示了三个双特异性抗體(tǐ)的例子：1. Hetero-lg；2.双可(kě)变结构域/dual variable domain；3.antibody-peptibody；这些代表了不同的分(fēn)子大小(xiǎo)，结构及复杂性。 目前的技术允许蛋白质结合域（protein binding domains）和抗體(tǐ)支架（antibody scaffolding）的多(duō)种组合，形成一系列独特的药物(wù)模式（drug modalities）。双特异性药物(wù)的几个功能(néng)类别包括：与可(kě)溶性靶标结合以抑制或刺激相关功能(néng)、与细胞靶标结合以拮抗或刺激相关功能(néng)、与细胞靶标结合以招募免疫细胞以促进抗體(tǐ)依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功能(néng)。 对双特异性分(fēn)子独特的结构和作用(yòng)机制(MOA)给药代动力學(xué)和药理(lǐ)學(xué)(PK/PD)评估，體(tǐ)内结构-功能(néng)关系的确定以及临床前和临床药物(wù)开发阶段所需的生物(wù)分(fēn)析支持带来了新(xīn)的挑战。双特异性抗體(tǐ) 双特异性抗體(tǐ)是通过基因工程重组生产的抗體(tǐ)，由两个不同的结合域（two distinct binding domains）组成，能(néng)够结合两种不同的抗原或同一抗原的两个不同表位。它们可(kě)以分(fēn)為(wèi)两个主要类别，即带有(yǒu)或缺少Fc區(qū)域的两类。关于生物(wù)分(fēn)析支持， FDA关于双特异性抗體(tǐ)开发的指南指出：可(kě)能(néng)需要开发多(duō)种PK定量方法，以定量总（total），结合（bound）和未结合（unbound）的双特异性抗體(tǐ)的浓度；也可(kě)能(néng)需要多(duō)个免疫原性测试方法，来测试对双特异性抗體(tǐ)不同结构域的免疫反应。 由于双特异的性质，双特异性抗體(tǐ)的未结合或“游离”PK定量方法可(kě)以包括三个测定方法：一个双功能(néng)方法同时测定两个活性结合域（active binding domains）和两个单功能(néng)方法分(fēn)别测定二个结合域中之一。双功能(néng)方法分(fēn)别使用(yòng)两个靶标蛋白作為(wèi)捕获和检测试剂。单功能(néng)方法使用(yòng)一个靶标蛋白作為(wèi)捕获试剂，而使用(yòng)抗人类IgG作為(wèi)检测试剂。通常，在解释检测结果时应谨慎，因為(wèi)单特异性方法缺乏特异性，故也能(néng)检测到双功能(néng)分(fēn)子。 双特异性抗體(tǐ)的定量PK分(fēn)析方法面临生物(wù)转化（biotransformation）的重大挑战，因此，通常定制开发方法以定量某个功能(néng)域生物(wù)转化的程度。独特的双特异性构造可(kě)能(néng)造成意外的生物(wù)转化路径，并可(kě)能(néng)使PK行為(wèi)复杂化。双特异性生物(wù)药的PK/PD 双特异性分(fēn)子增加了PK建模的复杂性，例如，表征靶向介导的药物(wù)处置需要考虑两个靶点的表达，它们以不同的频率出现在不同的细胞类型上。“游离”药物(wù)浓度与“总”药物(wù)浓度的定量，对于PK/PD建模至关重要，特别是当涉及可(kě)溶性靶点时；但是，由于靶标蛋白在體(tǐ)内的不同表达模式（expression patterns），药物(wù)定量分(fēn)析可(kě)能(néng)会变得更加复杂。在绝大多(duō)数的临床研究中，药物(wù)浓度是在所谓的“中央隔室central compartment”或系统循环（systemic circulation）中，以血浆或血清样本的形式，测定的，这在很(hěn)大程度上是由于易于从服用(yòng)药物(wù)的受试者中取样。根据几十年累积的科(kē)學(xué)数据，系统药物(wù)浓度（systemic drug concentrations）反映了药物(wù)在靶标作用(yòng)部位的浓度。血液病是一个例外，但即使是血液病也通常含有(yǒu)固體(tǐ)组织的部分(fēn)。系统药物(wù)浓度和作用(yòng)地点（site-of-action）的药物(wù)浓度之间的关系会因作用(yòng)地点的不同而不同，但适当的动物(wù)模型数据通常為(wèi)人體(tǐ)状况提供了可(kě)靠的模型。 由于药理(lǐ)學(xué)或药效學(xué)响应依赖于全身药物(wù)浓度，正确理(lǐ)解PK-PD关系对于预测达到预期响应的剂量和暴露量极為(wèi)有(yǒu)用(yòng)。同样重要的是，确定可(kě)能(néng)发生在每个独特的双特异性分(fēn)子上的任何潜在的體(tǐ)内生物(wù)转化（in vivo biotransformation），并彻底表征不同的药物(wù)在暴露量和活性方面的差异。总體(tǐ)来说，这些表征有(yǒu)助于理(lǐ)解药物(wù)的暴露量-响应关系，并提供了，基于药物(wù)变构體(tǐ)活性，优化剂量设计方案。 PK评估是非临床毒理(lǐ)學(xué)研究和临床开发的必然需求，在非临床疾病模型评估中也发挥着重要作用(yòng)；一般在非临床疾病模型评估中，研究药物(wù)剂量-响应的特性，用(yòng)以选择先导药物(wù)。非临床毒理(lǐ)學(xué)研究中的全身暴露量数据，可(kě)用(yòng)于确定首次对人(FIH)研究的安全起始剂量，该起始剂量是基于此类安全研究确定的暴露量余量（exposure margin）。暴露量余量由未观察到不良反应水平(NOAEL)的动物(wù)暴露量与选定人體(tǐ)剂量的预期暴露量的比值确定，通常设定為(wèi)比NOAEL预期的人體(tǐ)等效剂量(HED)低10倍。由于双特异性分(fēn)子可(kě)靶向多(duō)种生理(lǐ)或病理(lǐ)途径，因而可(kě)能(néng)具有(yǒu)更强的药理(lǐ)和/或毒理(lǐ)學(xué)作用(yòng)；故监管机构可(kě)能(néng)要求制药商(shāng)使用(yòng)“最低预期生物(wù)效应水平”（MABEL）模型来选择FIH剂量,这意味着需要比基于NOAEL更低的起始剂量。临床研究中较低的起始剂量，意味着可(kě)能(néng)需要提高PK方法的灵敏度；考虑到双特异性分(fēn)子的复杂性，这可(kě)能(néng)是一个挑战。 PK定量分(fēn)析方法 為(wèi)了支持符合药物(wù)预期用(yòng)途的PK数据的可(kě)靠性和有(yǒu)效性，监管机构希望制药商(shāng)，对所有(yǒu)的GLP研究/关键临床试验，使用(yòng)经过验证的分(fēn)析方法来定量药物(wù)浓度。监管部门為(wèi)生物(wù)分(fēn)析方法的验证提供了具體(tǐ)的指南，这些指南在全球各监管机构中普遍一致。这些指南文(wén)件清楚地阐明了对分(fēn)析方法参数的性能(néng)及其可(kě)接受值的监管期望，包括收集，储存和分(fēn)析过程中研究样本的完整性。关于检测试剂的讨论，特别是捕获和检测试剂的选择，分(fēn)析格式和技术平台，以及用(yòng)于PK表征和PK/PD相关性分(fēn)析的相关待测物(wù)，都可(kě)以在科(kē)學(xué)文(wén)献中找到。对于靶标在血液循环中的药物(wù)（这些靶标可(kě)在血清或血浆样本中形成药物(wù)-靶标复合物(wù)），关于应当测定的最相关的药物(wù)形式(不包括生物(wù)转化物(wù)/ biotransformants)仍然存在争议:“总體(tǐ)”(结合了 + 未结合靶标的药物(wù))或“游离部分(fēn)”或“活性部分(fēn)”(未结合靶标的部分(fēn))。关于总药物(wù)浓度和游离药物(wù)浓度的问题最好根据靶标的已知状况，药物(wù)的MOA和特征，项目团队的意见，技术可(kě)行性，以及监管反馈（如果需要的话），按个案处理(lǐ)的原则解决。最近有(yǒu)文(wén)献讨论了相关问题。LBA定量方法 生物(wù)分(fēn)析策略的选择可(kě)以根据药物(wù)特定的开发阶段而有(yǒu)所不同。例如,在非临床物(wù)种中研究人类蛋白药物(wù), 使用(yòng)不与非人类物(wù)种交叉反应的，针对人类蛋白的试剂，特别是非人灵長(cháng)类同源物(wù)，例如,重组人源化单克隆抗體(tǐ)（recombinant humanized monoclonal antibody，rhuMabs）,可(kě)以开发一种通用(yòng)的，快速且经济的PK分(fēn)析方法来测定总药物(wù)浓度，以支持全面的毒理(lǐ)學(xué)评价。然而,这种方法不能(néng)用(yòng)在临床研究中,更加药物(wù)特异性试剂，例如，靶标抗體(tǐ)和anti-idiotypic抗體(tǐ)，更可(kě)能(néng)是必要的：使用(yòng)通用(yòng)试剂与内源性分(fēn)子发生交叉反应会干扰蛋白药物(wù)浓度的定量，而测定游离药物(wù)的浓度与建立PK-PD关系息息相关。非临床和临床生物(wù)分(fēn)析策略的另一个问题是，使用(yòng)针对每个靶标结合位点（target binding site）的试剂，例如针对每个靶标结合域的靶标和/或anti-idiotypic抗體(tǐ)的组合，来测定完整的双特异性分(fēn)子是否最有(yǒu)价值。Anti-idiotypic 抗體(tǐ) 当一种抗體(tǐ)与另一种抗體(tǐ)的idiotope结合时，它被称為(wèi)抗idiotope抗體(tǐ)。抗體(tǐ)的可(kě)变部分(fēn)，包括独特的抗原结合位点，被称為(wèi)idiotope。Idiotopes内的表位组合对于每种抗體(tǐ)都是独一无二的(图2).由于目前开发的大多(duō)数单克隆抗體(tǐ)药物(wù)是人源的或人源化的，因此最可(kě)能(néng)诱导抗药物(wù)抗體(tǐ)（ADA）的免疫原性表位（immunogenic epitopes），存在于提供大多(duō)数结合接触面（binding contacts）的hypervariable complementarity determining regions（CDR）之内。可(kě)以生成抗idiotypic抗體(tǐ)，特异性地结合一个单克隆抗體(tǐ)药物(wù)。这些高度特异性的抗體(tǐ)可(kě)用(yòng)于，以不同测试格式，开发药代动力學(xué)（PK）定量方法，以测定临床前和临床样本中的游离药或总药物(wù)的浓度，或在ADA测试中作為(wèi)阳性对照等。图2. 抗體(tǐ)idiotope：抗體(tǐ)可(kě)变區(qū)域的，独特的抗原决定因素（antigenic determinants）的集合。 在这方面，药物(wù)的MOA在选择合适的分(fēn)析方法时很(hěn)重要，特别是在药物(wù)活性依赖于双特异性药物(wù)对两个靶点的同时作用(yòng)的情况下。抗CD3/抗肿瘤靶标双特异性药物(wù)就是一个例子：测定完整的，有(yǒu)活性的双特异性分(fēn)子是充分(fēn)表征该药物(wù)的最佳策略。反之，如果药物(wù)活性依赖于一个靶点的参与，而另一个靶点的参与只是增强了药物(wù)活性, 那么，测定完整药物(wù)可(kě)能(néng)就不那么重要了；此时，只使用(yòng)一种药物(wù)特异性试剂 (例如，单臂靶向/1-arm target，单臂/1-arm延長(cháng) PK或增加暴露量) 可(kě)能(néng)是合理(lǐ)的策略。另一种方法的一个例子是评估catumaxomab抗體(tǐ)的PK: 该PK分(fēn)析方法利用(yòng)了该抗體(tǐ)药物(wù)是小(xiǎo)鼠/大鼠的嵌合结构體(tǐ)，使用(yòng)了特异性的antispecies immunoglobulin的捕获/检测试剂。这里，使用(yòng)了一个针对药物(wù)的嵌合结构的混合通用(yòng)分(fēn)析格式（mixed generic assay format）；该方法特异性来自嵌合结构，而不涉及CDRs。这种方法基于两个假设: 首先，单克隆抗體(tǐ)(mAb)药物(wù)在體(tǐ)内通常非常稳定。其次，靶标蛋白没有(yǒu)可(kě)检测到的可(kě)溶性形式。因此，该PK分(fēn)析方法可(kě)以测定血液循环中游离的catumaxomab单抗，这是符合其预期用(yòng)途的。一般来说，默认的生物(wù)分(fēn)析策略是利用(yòng)双特异性药物(wù)的双特异性，但需要认识到开发这样的试剂是耗时的和有(yǒu)挑战的；并且可(kě)能(néng)在药物(wù)发现甚至非临床研究阶段还没有(yǒu)这样的试剂。下面将更详细地考量各种选择。PK定量方法的设计完整双特异性分(fēn)子的分(fēn)析方法 完整双特异性分(fēn)子定量的目的是测定生物(wù)基质中完整的双特异性分(fēn)子。该测试只测定有(yǒu)活性双特异性分(fēn)子，其没有(yǒu)任何功能(néng)區(qū)域被抗药物(wù)抗體(tǐ)(ADA)或血液循环中的靶点切断（clipped off）或阻断（blocked）。完整分(fēn)子的检测方法通常需要使用(yòng)靶标抗體(tǐ)和/或anti-idiotypic抗體(tǐ)，以测定包含可(kě)结合捕获和检测试剂这两个功能(néng)域的分(fēn)子。在评估體(tǐ)内或體(tǐ)外稳定性时(假设试剂可(kě)用(yòng))，建议采用(yòng)完整分(fēn)子的分(fēn)析方法。完整分(fēn)子定量的测试格式如图3A所示。 这种测试格式使用(yòng)两个靶标分(fēn)子或两个完全中和性的anti-idiotypic抗體(tǐ)，或两者的组合。最近， LC-MS，结合affinity pull-down（使用(yòng)靶标或anti-idiotypic抗體(tǐ)）以分(fēn)离待测物(wù)，已用(yòng)于表征的生物(wù)基质中的药物(wù)完整分(fēn)子。Affinity pull-down是一种类似于免疫沉淀（immunoprecipitation）的小(xiǎo)规模亲和纯化技术，只是抗體(tǐ)也可(kě)以被其它亲和系统所取代。 这是一种sequential方法：首先，使用(yòng)anti-idotypic抗體(tǐ)来下拉（pull down）双特异性药物(wù)的游离形式；然后，用(yòng)LC-MS法进行定量。利用(yòng)这种形式，可(kě)以确定双特异性分(fēn)子的游离浓度。然而，在方法开发过程中需要考虑几个关键因素: 该测试格式必须设计好，以避免潜在的空间位阻效应（steric hindrance）。一些双特异性分(fēn)子被设计為(wèi)靶向一个可(kě)溶性分(fēn)子和一个与细胞结合的分(fēn)子(细胞表面受體(tǐ))。这种双特异性分(fēn)子被明确设计為(wèi)与两个靶点同时相互作用(yòng)，以发挥其预期的药理(lǐ)活性。然而，双特异性分(fēn)子和检测试剂在检测环境中可(kě)能(néng)有(yǒu)不同的相互作用(yòng)，换句话说，在塑料容器表面可(kě)能(néng)表现出不同的相互作用(yòng)。因此，应该理(lǐ)解和谨慎的处理(lǐ)空间位阻效应。例如，从位阻效应研究中收集的数据，例如，在Octet平台上考查域结合干扰（domain binding interferences）的数据，可(kě)能(néng)指向选择一个特定的捕获和检测顺序，以避免不必要的空间位阻效应; 一些双特异性分(fēn)子，通过协同作用(yòng)，具有(yǒu)很(hěn)高的药效學(xué)效力（highly pharmacologically potent），这可(kě)能(néng)意味着只需要非常低的临床剂量。因此, 基于已知的剂量-响应数据和剂量模型（dose modelling）的分(fēn)析方法灵敏度将会是一个重要的考量指标; 与传统的单特异性抗體(tǐ)相比，双特异性分(fēn)子更有(yǒu)可(kě)能(néng)出现體(tǐ)内生物(wù)转化（biotransformation），即體(tǐ)内不稳定性（in vivo instability）。生物(wù)转化不仅可(kě)能(néng)影响双特异性分(fēn)子的活性，而且还可(kě)能(néng)影响定量双特异性分(fēn)子的可(kě)靠性。因此，完全中和性，anti-idiotypic抗體(tǐ)或靶标分(fēn)子(图3A)有(yǒu)可(kě)能(néng)允许检测潜在的生物(wù)转化（consequential biotransformation）; 图3. 用(yòng)于定量双特异性分(fēn)子的不同测试格式和试剂。(A)完整分(fēn)子的测定方法：使用(yòng)靶标蛋白X和靶标蛋白Y作為(wèi)检测试剂，测定完整双特异性分(fēn)子的浓度。(B) 功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和靶标Y蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域Y的浓度。(C)功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和X靶标蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用(yòng)两种抗Fc抗體(tǐ)作為(wèi)测试试剂来测定双特异性分(fēn)子的所有(yǒu)可(kě)溶形式。 与单特异性生物(wù)药分(fēn)子类似，如常规的单克隆抗體(tǐ)，ADA可(kě)以通过阻断捕获或检测试剂与药物(wù)的结合来干扰对双特异性分(fēn)子的定量(注意不要与改变的药物(wù)清除率相混淆)。此外，一个结构域可(kě)能(néng)是immunodominant；那么取决于测试格式，这可(kě)能(néng)会导致PK分(fēn)析结果的差异。另外，也许除了内源性的IgG4分(fēn)子之外，双特异性分(fēn)子所固有(yǒu)的新(xīn)颖，非天然结构，可(kě)能(néng)使双特异性分(fēn)子比单特异性分(fēn)子更容易诱发ADA反应，这是免疫原性风险评估的一个考虑因素。功能(néng)域分(fēn)析（functional domain assay） 功能(néng)域分(fēn)析是测定一个功能(néng)域的浓度，此格式可(kě)用(yòng)于展示相关的单一功能(néng)域的浓度。当双特异性的MOA使得药物(wù)分(fēn)子的一部分(fēn)（a partial molecule）保留部分(fēn)活性时(如可(kě)溶性靶标，融合蛋白，或肽激动剂)，这些检测显得尤為(wèi)重要。功能(néng)域分(fēn)析的目的是确定哪个功能(néng)域是有(yǒu)活性的，因此，可(kě)用(yòng)于解释与ADA的形成或生物(wù)转化相关的功能(néng)丧失。 单域测试格式的设计如图3B和3C所示。该方法特意使用(yòng)药物(wù)靶标，或抑制性anti-idiotypic抗體(tǐ)来分(fēn)析双特异性分(fēn)子的游离结构域（free domain）， 并与抗Fc或抗框架（anti-framework）抗體(tǐ)，作為(wèi)捕获或检测试剂，联用(yòng)。这些分(fēn)析方法可(kě)用(yòng)于药物(wù)开发的任何阶段。有(yǒu)时，基于细胞的测试方法可(kě)以用(yòng)于测量单个功能(néng)域，如blinatumomab情况。 图3. 用(yòng)于定量双特异性分(fēn)子的不同测试格式和试剂。(A)完整分(fēn)子的测定方法：使用(yòng)靶标蛋白X和靶标蛋白Y作為(wèi)检测试剂，测定完整双特异性分(fēn)子的浓度。(B) 功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和靶标Y蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域Y的浓度。(C)功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和X靶标蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用(yòng)两种抗Fc抗體(tǐ)作為(wèi)测试试剂来测定双特异性分(fēn)子的所有(yǒu)可(kě)溶形式。总浓度分(fēn)析方法（total assay） 总體(tǐ)测定法（total assay）用(yòng)于测定双特异性分(fēn)子的所有(yǒu)可(kě)溶形式。这种测试格式可(kě)用(yòng)于显示双特异性分(fēn)子的存在，而不考虑任何结构或功能(néng)的变化。该分(fēn)析方法通常用(yòng)于测定蛋白质的主（骨）干（backbone）结构，如Fc结构域。但这可(kě)能(néng)并不适用(yòng)于所有(yǒu)的构造；取决于构造的性质，也不一定适用(yòng)于所有(yǒu)的分(fēn)子变构體(tǐ)，例如，在临床研究中rhuMab双特异性药物(wù)。总體(tǐ)测定法应当耐受ADA和与靶标的结合（target binding）。图3D描述了总體(tǐ)测定法，其中两个与不同表位结合的抗人Fc抗體(tǐ)可(kě)以用(yòng)作捕获和检测试剂。 图3. 用(yòng)于定量双特异性分(fēn)子的不同测试格式和试剂。(A)完整分(fēn)子的测定方法：使用(yòng)靶标蛋白X和靶标蛋白Y作為(wèi)检测试剂，测定完整双特异性分(fēn)子的浓度。(B) 功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和靶标Y蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域Y的浓度。(C)功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和X靶标蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用(yòng)两种抗Fc抗體(tǐ)作為(wèi)测试试剂来测定双特异性分(fēn)子的所有(yǒu)可(kě)溶形式。 同样，单一多(duō)克隆抗人IgG试剂也可(kě)用(yòng)作捕获和检测试剂。但此方法只用(yòng)于非临床研究。对于测量总體(tǐ)药物(wù)浓度， LC-MS非常有(yǒu)用(yòng)，特别是当没有(yǒu)特定的试剂可(kě)用(yòng)时。总體(tǐ)测定法可(kě)与“完整intact”或“有(yǒu)效active”药物(wù)测定法，结合使用(yòng)，或同时使用(yòng)两者，以评估體(tǐ)内外（in vivo /ex vivo）的稳定性，以及生物(wù)转化（biotransformation）对结构-功能(néng)关系的影响，例如，某些deamidation或氧化反应可(kě)能(néng)破坏药物(wù)与靶标的结合。 PK样本中生物(wù)环境的复杂性為(wèi)使用(yòng)哪一种定量方法增加了另一层挑战。生物(wù)分(fēn)析方法的应用(yòng)是从药物(wù)发现和临床前安全性评估期间的动物(wù)研究开始的，持续到临床开发，并延伸到上市后的生命周期管理(lǐ)(即附加适应症和/或组合疗法)。正如前面所指出的，不同的分(fēn)析策略可(kě)以在不同的开发阶段使用(yòng)；当體(tǐ)内结构-功能(néng)关系确立之后，可(kě)以在药物(wù)发现和开发的整个过程中开发和使用(yòng)单一的定量分(fēn)析方法。但是，需要对分(fēn)析方法的生命周期管理(lǐ)有(yǒu)特殊考虑，以便将来自多(duō)个物(wù)种和不同目标患者群體(tǐ)的PK/PD知识整合到所探索适应症中去。双特异性分(fēn)子的方法验证和认证（method validation & qualification） 对双特异性分(fēn)子的方法验证和认证与其他(tā)大分(fēn)子一样，包括精密度和准确度，稀释線(xiàn)性度，选择性，干扰和特异性，以及稳定性测试，以确保数据的稳健性和完整性。然而，由于双特异性分(fēn)子的性质，如上所述，在开发完整分(fēn)子的分(fēn)析方法时，对这两个结构域的特异性和分(fēn)析干扰的评估都是必要的。特别声明 本文(wén)如有(yǒu)疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有(yǒu)引用(yòng)的原始信息和资料均来自已经发表學(xué)术期刊, 官方网络报道, 等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文(wén)献的选择考虑到多(duō)样化但也不可(kě)能(néng)完备。欢迎读者提供有(yǒu)价值的文(wén)献及其评估。参考文(wén)献1.Zhu, L, et al. (2020). "Bioanalytical Challenges in Support of Complex Modalities of Antibody-Based Therapeutics." AAPS J 22(6): 130.2.Ma, M., et al. (2019). "Bioanalytical challenges and unique considerations to support pharmacokinetic characterization of bispecific biotherapeutics." Bioanalysis 11(5): 427-435.3.Seimetz D. Novel monoclonal antibodies for cancer treatment: the trifunctional antibody catumaxomab (removab). J. Cancer 2, 309–316 (2011).4.Mullard A. Bispecific antibody pipeline moves beyond oncology. Nat. Rev. Drug Discov. 16(11), 666–668 (2017).5.Diao L, Meibohm B. Tools for predicting the PK/PD of therapeutic proteins. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol. 11(7), 1115–1125 (2015).6.Trivedi A, et al. Clinical pharmacology and translational aspects of bispecific antibodies. Clin. Transl. Sci. 10(3), 147–162 (2017).7.Ezan E, et al. Assessment of the metabolism of therapeutic proteins and antibodies. Expert Opin. Drug Metab. Toxicol.10(8), 1079–1091 (2014).8.Fischer SK, et al. The assay design used for measurement of therapeutic antibody concentrations can affect pharmacokinetic parameters. Case studies. MAbs 4(5), 623–631 (2012).9.Ruf P, et al. Pharmacokinetics, immunogenicity and bioactivity of the therapeutic antibody catumaxomab intraperitoneally administered to cancer patients. Br. J. Clin. Pharmacol. 69(6), 617–625 (2010).10.Samineni D, et al. Impact of shed/soluble targets on the PK/PD of approved therapeutic monoclonal antibodies. Exp. Rev. Clin. Pharm. 9(12), 1557–1569 (2016).11.Villegas VM, et al. Current advances in the treatment of neovascular age-related macular degeneration. Expert Opin. Drug Deliv. 14(2), 273–282 (2017).12.Ruppel J, et al. Preexisting antibodies to an F(ab’)2 antibody therapeutic and novel method for immunogenicity assessment. J. Immunol. Res. 2016, 1–8 (2016).13.Fan X, et al. Lens glutathione homeostasis: discrepancies and gaps in knowledge standing in the way of novel therapeutic approaches. Exp. Eye Res. 156, 103–111 (2017).14.Kang L, et al. LC-MS bioanalysis of intact proteins and peptides. Biomed Chromatogr. 2020;34(1):e4633. https://doi.org/10.1002/bmc.4633.15.Chen, J, et al. "Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics." Journal of translational medicine 13: 182. (2015)16.Murphy RE, et al. Combined use of immunoassay and twodimensional liquid chromatography mass spectrometry for the detection and identification of metabolites from biotherapeutic pharmacokinetic samples. J Pharmaceut Biomed.2010;53(3):221–7. https://doi.org/10.1016/j.jpba.2010.04.028.17.He JT, et al. High resolution accurate-mass mass spectrometry enabling in-depth characterization of in vivo biotransformations for intact antibody-drug conjugates. Anal Chem. 2017;89(10):5476–83.https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b00408.18.Jian WY, et al. A workflow for absolute quantitation of large therapeutic proteins in biological samples at intact level using LC-HRMS. Bioanalysis.2016;8(16):1679–91. https://doi.org/10.4155/bio-2016-0096.19.Lanshoeft C, et al. Generic hybrid ligand binding assay liquid chromatography high resolution mass spectrometry based workflow for multiplexed human immunoglobulin G1 quantification at the intact protein level: application to preclinical pharmacokinetic studies. Anal Chem. 2017;89(4):2628–35. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.6b04997.20.Jin W, et al. LC-HRMS quantitation of intact antibody drug conjugate trastuzumab emtansine from rat plasma. Bioanalysis. 2018;10(11):851–62. https://doi.org/10.4155/bio-2018-0003.21.Zhang LY, et al. Top-down LC-MS quantitation of intact denatured and native monoclonal antibodies in biological samples. Bioanalysis. 2018;10(13):1039–54. https://doi.org/10.4155/bio-2017-0282.22.Li Y, et al. An efficient and quantitative assay for epitope-tagged therapeutic protein development with a capillary western system. Bioanalysis. 2019;11(6):471–84. https://doi.org/10.4155/bio-2018-0248.23.Kodani M, et al. An automated immunoblot method for detection of IgG antibodies to hepatitis C virus: a potential supplemental antibody confirmatory assay. J Clin Microbiol. 2019;57(3). https://doi.org/10.1128/JCM.01567-18.关于博济医药 临床研究服務(wù)：博济医药拥有(yǒu)一支规模庞大、专业成熟的临床研究队伍，可(kě)提供包括医學(xué)、项目管理(lǐ)、监查、稽查、数据管理(lǐ)和统计分(fēn)析、生物(wù)样本检测在内的临床试验全流程解决方案。截至2020年，博济医药服務(wù)的客户超1000家，完成800多(duō)项临床试验项目，助力客户获得新(xīn)药证书60多(duō)项、生产批件超过80项。拥有(yǒu)丰富的临床试验服務(wù)经验，服務(wù)项目涵盖临床研究各个领域，在肿瘤、肝病、消化等创新(xīn)药领域拥有(yǒu)独特的临床服務(wù)體(tǐ)系。 博济医药在全國(guó)设有(yǒu)40多(duō)个临床监查网点，与全國(guó)近600个临床试验机构展开合作，并运用(yòng)ORACLE OC/RDC及CTMS系统，控制临床数据采集的及时性、管理(lǐ)临床试验过程的规范性。