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股票代码為(wèi)（300404）创建于2002年，2015年在深圳创业板上市，是一家為(wèi)國(guó)内外医药企业提供药品、保健品、医疗器械研发与生产全流程“一站式”外包服務(wù)(CRO)的型高新(xīn)技术企业，同也提供药品上市许可(kě)持有(yǒu)人(MAH)服務(wù)。
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药品研发“一站式”服務(wù)包括：新(xīn)药立项研究和活性筛选、药學(xué)研究(含中试生产)、药理(lǐ)毒理(lǐ)研究、临床用(yòng)药与模拟剂的生产、临床试验、临床数据管理(lǐ)和统计分(fēn)析、上市后再评价、技
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公司新(xīn)闻
袁来如此 | 大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析概论（十四_上）：LBA定量分(fēn)析双特异性生物(wù)药的挑战
作者：广州博济医药 时间：2021-08-18 来源：广州博济医药
     本文(wén)為(wèi)系列文(wén)章《大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析概论》的第十四篇，旨在根据已发表的文(wén)献资料，初步的介绍定量分(fēn)析双特异性抗體(tǐ)的LBA方法所面临的挑战。
 
     由于内容篇幅较長(cháng)，本文(wén)将采取上下篇形式进行推送，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州博济医药微信公众号打造的科(kē)普學(xué)术专栏，内容均為(wèi)博济医药药物(wù)研究中心资深科(kē)學(xué)顾问袁智博士原创。

 
     与传统（单特异性）的生物(wù)药相比，双特异性生物(wù)药对其药代动力學(xué)（PK）的表征提出了独特的挑战。在此背景下，开发生物(wù)药的生物(wù)分(fēn)析策略正在迅速演变，以支持这些不断变化的药物(wù)模式。


     一般说来，生物(wù)分(fēn)析策略应根据药物(wù)的作用(yòng)机制（mechanism of action，MOA）和开发阶段定制。对于 mAb 药物(wù)，用(yòng)于分(fēn)析药代/毒代动力學(xué)（PK/TK），药效动力學(xué)和免疫原性的分(fēn)析方法通常分(fēn)别為(wèi)定量分(fēn)析、“游离”和“总”药物(wù)浓度、“游离”和“总”靶标浓度、抗药物(wù)抗體(tǐ)（ADAs）和中和性 ADAs的开发和验证。对于具有(yǒu)复杂结构的抗體(tǐ)衍生物(wù)（antibody derivatives），衍生物(wù)的每个功能(néng)域可(kě)能(néng)需要额外的一组检测方法，从而可(kě)能(néng)导致测试方法的数量几何级增長(cháng)。


     此外，与开发默认没有(yǒu)生物(wù)转化（biotransformation）的mAb相比，复杂的抗體(tǐ)衍生物(wù)更容易发生生物(wù)转化，这意味着可(kě)能(néng)需要另一组测试方法来描述复杂抗體(tǐ)药物(wù)的结构完整性及其生物(wù)转化后的各种产物(wù)（biotransformed variants）。


     配體(tǐ)结合式测试方法（LBA）是mAbs生物(wù)分(fēn)析的主力军，同时液相色谱-质谱方法（LC-MS）也在近年越来越受欢迎。这两种分(fēn)析技术也主要应用(yòng)于抗體(tǐ)药物(wù)及其衍生物(wù)的生物(wù)分(fēn)析。

 
     由于药物(wù)模式的复杂性，通常需要多(duō)个 LBA/LC-MS 分(fēn)析方法。当每个分(fēn)析方法都有(yǒu)特定的取样程序，而且并非所有(yǒu)的检测可(kě)以在一个生物(wù)分(fēn)析实验室实施时，独特的样本采集、处理(lǐ)、储存、运输和分(fēn)析条件，会造成复杂的后勤需求。因此，需要设计一种生物(wù)分(fēn)析策略，用(yòng)于表征双特异性分(fēn)子的PK特性，并研究其體(tǐ)内结构-功能(néng)关系。本文(wén)提供了若干相关案例研究和监管层面的预测。

导论

    近年来，蛋白质工程和生产方面的进展推动着生物(wù)制药行业开发越来越复杂的蛋白质药物(wù)，其能(néng)够结合多(duō)个药物(wù)治疗靶标，故能(néng)够提高疗效和/或者减少剂量，用(yòng)以降低毒性，使安全风险最小(xiǎo)化，提高用(yòng)药的方便性和依从性等。双特异性药物(wù)被定义為(wèi)基于抗體(tǐ)（antibody-based）或基于框架（scaffold-based）的蛋白质药物(wù)，其包含一个以上的工程改造功能(néng)區(qū)域，该功能(néng)區(qū)域结合两个或多(duō)个独立的抗原靶点。本文(wén)集中关注双特异性药物(wù)的两个独特的功能(néng)域，其结合与疾病的发生和进展相关的蛋白质，而不考虑抗體(tǐ)骨（主）干（antibody backbone）的功能(néng)。


    开发双特异性生物(wù)药的领域，基于并发展了传统的单分(fēn)子靶点的抗體(tǐ)免疫疗法的框架，正在蓬勃发展，以靶向协同的分(fēn)子途径（target synergistic molecular pathways）来更有(yǒu)效地治疗疾病。两种双特异性抗體(tǐ)，blinatumomab（Blincyto）和catumaxomab（Removab）已经在美國(guó)或欧盟批准上市，用(yòng)于肿瘤适应症的治疗；这证明了这类药物(wù)分(fēn)子的应用(yòng)价值。目前有(yǒu)60多(duō)种用(yòng)于癌症和其它疾病的新(xīn)型双特异性生物(wù)药正在临床开发之中。


双特异性生物(wù)药分(fēn)子


     双特异性分(fēn)子可(kě)以以各种不同的结构呈现，利用(yòng)抗體(tǐ)可(kě)用(yòng)的各种结合域。这些结合域包括可(kě)变重链(VH)、可(kě)变轻链(VL)、单链分(fēn)子(ScFv)和/或抗體(tǐ)的Fc域，可(kě)以组合使用(yòng)这些结构域，以结合多(duō)个分(fēn)子靶标。具有(yǒu)多(duō)个Fab结合域的双可(kě)变域免疫球蛋白(dual-variable domain immunoglobulin，DVD -Ig)这样的大型免疫球蛋白分(fēn)子和较小(xiǎo)的串联ScFv结构域(diabody)，在分(fēn)子大小(xiǎo)和结构上代表了两个极端，它们都可(kě)通过各种蛋白质工程技术生产出来(图1)。

    图1. 双特异性分(fēn)子的构造。本图展示了三个双特异性抗體(tǐ)的例子：1. Hetero-lg；2.双可(kě)变结构域/dual variable domain；3.antibody-peptibody；这些代表了不同的分(fēn)子大小(xiǎo)，结构及复杂性。



      目前的技术允许蛋白质结合域（protein binding domains）和抗體(tǐ)支架（antibody scaffolding）的多(duō)种组合，形成一系列独特的药物(wù)模式（drug modalities）。双特异性药物(wù)的几个功能(néng)类别包括：与可(kě)溶性靶标结合以抑制或刺激相关功能(néng)、与细胞靶标结合以拮抗或刺激相关功能(néng)、与细胞靶标结合以招募免疫细胞以促进抗體(tǐ)依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)功能(néng)。


     对双特异性分(fēn)子独特的结构和作用(yòng)机制(MOA)给药代动力學(xué)和药理(lǐ)學(xué)(PK/PD)评估，體(tǐ)内结构-功能(néng)关系的确定以及临床前和临床药物(wù)开发阶段所需的生物(wù)分(fēn)析支持带来了新(xīn)的挑战。


双特异性抗體(tǐ)

     双特异性抗體(tǐ)是通过基因工程重组生产的抗體(tǐ)，由两个不同的结合域（two distinct binding domains）组成，能(néng)够结合两种不同的抗原或同一抗原的两个不同表位。它们可(kě)以分(fēn)為(wèi)两个主要类别，即带有(yǒu)或缺少Fc區(qū)域的两类。关于生物(wù)分(fēn)析支持， FDA关于双特异性抗體(tǐ)开发的指南指出：可(kě)能(néng)需要开发多(duō)种PK定量方法，以定量总（total），结合（bound）和未结合（unbound）的双特异性抗體(tǐ)的浓度；也可(kě)能(néng)需要多(duō)个免疫原性测试方法，来测试对双特异性抗體(tǐ)不同结构域的免疫反应。

 
 
     由于双特异的性质，双特异性抗體(tǐ)的未结合或“游离”PK定量方法可(kě)以包括三个测定方法：一个双功能(néng)方法同时测定两个活性结合域（active binding domains）和两个单功能(néng)方法分(fēn)别测定二个结合域中之一。双功能(néng)方法分(fēn)别使用(yòng)两个靶标蛋白作為(wèi)捕获和检测试剂。单功能(néng)方法使用(yòng)一个靶标蛋白作為(wèi)捕获试剂，而使用(yòng)抗人类IgG作為(wèi)检测试剂。通常，在解释检测结果时应谨慎，因為(wèi)单特异性方法缺乏特异性，故也能(néng)检测到双功能(néng)分(fēn)子。


     双特异性抗體(tǐ)的定量PK分(fēn)析方法面临生物(wù)转化（biotransformation）的重大挑战，因此，通常定制开发方法以定量某个功能(néng)域生物(wù)转化的程度。独特的双特异性构造可(kě)能(néng)造成意外的生物(wù)转化路径，并可(kě)能(néng)使PK行為(wèi)复杂化。


双特异性生物(wù)药的PK/PD


    双特异性分(fēn)子增加了PK建模的复杂性，例如，表征靶向介导的药物(wù)处置需要考虑两个靶点的表达，它们以不同的频率出现在不同的细胞类型上。“游离”药物(wù)浓度与“总”药物(wù)浓度的定量，对于PK/PD建模至关重要，特别是当涉及可(kě)溶性靶点时；但是，由于靶标蛋白在體(tǐ)内的不同表达模式（expression patterns），药物(wù)定量分(fēn)析可(kě)能(néng)会变得更加复杂。在绝大多(duō)数的临床研究中，药物(wù)浓度是在所谓的“中央隔室central compartment”或系统循环（systemic circulation）中，以血浆或血清样本的形式，测定的，这在很(hěn)大程度上是由于易于从服用(yòng)药物(wù)的受试者中取样。根据几十年累积的科(kē)學(xué)数据，系统药物(wù)浓度（systemic drug concentrations）反映了药物(wù)在靶标作用(yòng)部位的浓度。血液病是一个例外，但即使是血液病也通常含有(yǒu)固體(tǐ)组织的部分(fēn)。系统药物(wù)浓度和作用(yòng)地点（site-of-action）的药物(wù)浓度之间的关系会因作用(yòng)地点的不同而不同，但适当的动物(wù)模型数据通常為(wèi)人體(tǐ)状况提供了可(kě)靠的模型。

 
     由于药理(lǐ)學(xué)或药效學(xué)响应依赖于全身药物(wù)浓度，正确理(lǐ)解PK-PD关系对于预测达到预期响应的剂量和暴露量极為(wèi)有(yǒu)用(yòng)。同样重要的是，确定可(kě)能(néng)发生在每个独特的双特异性分(fēn)子上的任何潜在的體(tǐ)内生物(wù)转化（in vivo biotransformation），并彻底表征不同的药物(wù)在暴露量和活性方面的差异。总體(tǐ)来说，这些表征有(yǒu)助于理(lǐ)解药物(wù)的暴露量-响应关系，并提供了，基于药物(wù)变构體(tǐ)活性，优化剂量设计方案。


    PK评估是非临床毒理(lǐ)學(xué)研究和临床开发的必然需求，在非临床疾病模型评估中也发挥着重要作用(yòng)；一般在非临床疾病模型评估中，研究药物(wù)剂量-响应的特性，用(yòng)以选择先导药物(wù)。非临床毒理(lǐ)學(xué)研究中的全身暴露量数据，可(kě)用(yòng)于确定首次对人(FIH)研究的安全起始剂量，该起始剂量是基于此类安全研究确定的暴露量余量（exposure margin）。暴露量余量由未观察到不良反应水平(NOAEL)的动物(wù)暴露量与选定人體(tǐ)剂量的预期暴露量的比值确定，通常设定為(wèi)比NOAEL预期的人體(tǐ)等效剂量(HED)低10倍。由于双特异性分(fēn)子可(kě)靶向多(duō)种生理(lǐ)或病理(lǐ)途径，因而可(kě)能(néng)具有(yǒu)更强的药理(lǐ)和/或毒理(lǐ)學(xué)作用(yòng)；故监管机构可(kě)能(néng)要求制药商(shāng)使用(yòng)“最低预期生物(wù)效应水平”（MABEL）模型来选择FIH剂量,这意味着需要比基于NOAEL更低的起始剂量。临床研究中较低的起始剂量，意味着可(kě)能(néng)需要提高PK方法的灵敏度；考虑到双特异性分(fēn)子的复杂性，这可(kě)能(néng)是一个挑战。

 
PK定量分(fēn)析方法

 
    為(wèi)了支持符合药物(wù)预期用(yòng)途的PK数据的可(kě)靠性和有(yǒu)效性，监管机构希望制药商(shāng)，对所有(yǒu)的GLP研究/关键临床试验，使用(yòng)经过验证的分(fēn)析方法来定量药物(wù)浓度。监管部门為(wèi)生物(wù)分(fēn)析方法的验证提供了具體(tǐ)的指南，这些指南在全球各监管机构中普遍一致。这些指南文(wén)件清楚地阐明了对分(fēn)析方法参数的性能(néng)及其可(kě)接受值的监管期望，包括收集，储存和分(fēn)析过程中研究样本的完整性。关于检测试剂的讨论，特别是捕获和检测试剂的选择，分(fēn)析格式和技术平台，以及用(yòng)于PK表征和PK/PD相关性分(fēn)析的相关待测物(wù)，都可(kě)以在科(kē)學(xué)文(wén)献中找到。对于靶标在血液循环中的药物(wù)（这些靶标可(kě)在血清或血浆样本中形成药物(wù)-靶标复合物(wù)），关于应当测定的最相关的药物(wù)形式(不包括生物(wù)转化物(wù)/ biotransformants)仍然存在争议:“总體(tǐ)”(结合了 + 未结合靶标的药物(wù))或“游离部分(fēn)”或“活性部分(fēn)”(未结合靶标的部分(fēn))。关于总药物(wù)浓度和游离药物(wù)浓度的问题最好根据靶标的已知状况，药物(wù)的MOA和特征，项目团队的意见，技术可(kě)行性，以及监管反馈（如果需要的话），按个案处理(lǐ)的原则解决。最近有(yǒu)文(wén)献讨论了相关问题。


LBA定量方法


   生物(wù)分(fēn)析策略的选择可(kě)以根据药物(wù)特定的开发阶段而有(yǒu)所不同。例如,在非临床物(wù)种中研究人类蛋白药物(wù), 使用(yòng)不与非人类物(wù)种交叉反应的，针对人类蛋白的试剂，特别是非人灵長(cháng)类同源物(wù)，例如,重组人源化单克隆抗體(tǐ)（recombinant humanized monoclonal antibody，rhuMabs）,可(kě)以开发一种通用(yòng)的，快速且经济的PK分(fēn)析方法来测定总药物(wù)浓度，以支持全面的毒理(lǐ)學(xué)评价。然而,这种方法不能(néng)用(yòng)在临床研究中,更加药物(wù)特异性试剂，例如，靶标抗體(tǐ)和anti-idiotypic抗體(tǐ)，更可(kě)能(néng)是必要的：使用(yòng)通用(yòng)试剂与内源性分(fēn)子发生交叉反应会干扰蛋白药物(wù)浓度的定量，而测定游离药物(wù)的浓度与建立PK-PD关系息息相关。非临床和临床生物(wù)分(fēn)析策略的另一个问题是，使用(yòng)针对每个靶标结合位点（target binding site）的试剂，例如针对每个靶标结合域的靶标和/或anti-idiotypic抗體(tǐ)的组合，来测定完整的双特异性分(fēn)子是否最有(yǒu)价值。

Anti-idiotypic 抗體(tǐ)

   当一种抗體(tǐ)与另一种抗體(tǐ)的idiotope结合时，它被称為(wèi)抗idiotope抗體(tǐ)。抗體(tǐ)的可(kě)变部分(fēn)，包括独特的抗原结合位点，被称為(wèi)idiotope。Idiotopes内的表位组合对于每种抗體(tǐ)都是独一无二的(图2).由于目前开发的大多(duō)数单克隆抗體(tǐ)药物(wù)是人源的或人源化的，因此最可(kě)能(néng)诱导抗药物(wù)抗體(tǐ)（ADA）的免疫原性表位（immunogenic epitopes），存在于提供大多(duō)数结合接触面（binding contacts）的hypervariable complementarity determining regions（CDR）之内。可(kě)以生成抗idiotypic抗體(tǐ)，特异性地结合一个单克隆抗體(tǐ)药物(wù)。这些高度特异性的抗體(tǐ)可(kě)用(yòng)于，以不同测试格式，开发药代动力學(xué)（PK）定量方法，以测定临床前和临床样本中的游离药或总药物(wù)的浓度，或在ADA测试中作為(wèi)阳性对照等。

图2. 抗體(tǐ)idiotope：抗體(tǐ)可(kě)变區(qū)域的，独特的抗原决定因素（antigenic determinants）的集合。



    在这方面，药物(wù)的MOA在选择合适的分(fēn)析方法时很(hěn)重要，特别是在药物(wù)活性依赖于双特异性药物(wù)对两个靶点的同时作用(yòng)的情况下。抗CD3/抗肿瘤靶标双特异性药物(wù)就是一个例子：测定完整的，有(yǒu)活性的双特异性分(fēn)子是充分(fēn)表征该药物(wù)的最佳策略。反之，如果药物(wù)活性依赖于一个靶点的参与，而另一个靶点的参与只是增强了药物(wù)活性, 那么，测定完整药物(wù)可(kě)能(néng)就不那么重要了；此时，只使用(yòng)一种药物(wù)特异性试剂 (例如，单臂靶向/1-arm target，单臂/1-arm延長(cháng) PK或增加暴露量) 可(kě)能(néng)是合理(lǐ)的策略。另一种方法的一个例子是评估catumaxomab抗體(tǐ)的PK: 该PK分(fēn)析方法利用(yòng)了该抗體(tǐ)药物(wù)是小(xiǎo)鼠/大鼠的嵌合结构體(tǐ)，使用(yòng)了特异性的antispecies immunoglobulin的捕获/检测试剂。这里，使用(yòng)了一个针对药物(wù)的嵌合结构的混合通用(yòng)分(fēn)析格式（mixed generic assay format）；该方法特异性来自嵌合结构，而不涉及CDRs。这种方法基于两个假设: 首先，单克隆抗體(tǐ)(mAb)药物(wù)在體(tǐ)内通常非常稳定。其次，靶标蛋白没有(yǒu)可(kě)检测到的可(kě)溶性形式。因此，该PK分(fēn)析方法可(kě)以测定血液循环中游离的catumaxomab单抗，这是符合其预期用(yòng)途的。一般来说，默认的生物(wù)分(fēn)析策略是利用(yòng)双特异性药物(wù)的双特异性，但需要认识到开发这样的试剂是耗时的和有(yǒu)挑战的；并且可(kě)能(néng)在药物(wù)发现甚至非临床研究阶段还没有(yǒu)这样的试剂。下面将更详细地考量各种选择。

PK定量方法的设计

完整双特异性分(fēn)子的分(fēn)析方法

 
    完整双特异性分(fēn)子定量的目的是测定生物(wù)基质中完整的双特异性分(fēn)子。该测试只测定有(yǒu)活性双特异性分(fēn)子，其没有(yǒu)任何功能(néng)區(qū)域被抗药物(wù)抗體(tǐ)(ADA)或血液循环中的靶点切断（clipped off）或阻断（blocked）。完整分(fēn)子的检测方法通常需要使用(yòng)靶标抗體(tǐ)和/或anti-idiotypic抗體(tǐ)，以测定包含可(kě)结合捕获和检测试剂这两个功能(néng)域的分(fēn)子。在评估體(tǐ)内或體(tǐ)外稳定性时(假设试剂可(kě)用(yòng))，建议采用(yòng)完整分(fēn)子的分(fēn)析方法。完整分(fēn)子定量的测试格式如图3A所示。

 
     这种测试格式使用(yòng)两个靶标分(fēn)子或两个完全中和性的anti-idiotypic抗體(tǐ)，或两者的组合。最近， LC-MS，结合affinity pull-down（使用(yòng)靶标或anti-idiotypic抗體(tǐ)）以分(fēn)离待测物(wù)，已用(yòng)于表征的生物(wù)基质中的药物(wù)完整分(fēn)子。Affinity pull-down是一种类似于免疫沉淀（immunoprecipitation）的小(xiǎo)规模亲和纯化技术，只是抗體(tǐ)也可(kě)以被其它亲和系统所取代。

 
     这是一种sequential方法：首先，使用(yòng)anti-idotypic抗體(tǐ)来下拉（pull down）双特异性药物(wù)的游离形式；然后，用(yòng)LC-MS法进行定量。利用(yòng)这种形式，可(kě)以确定双特异性分(fēn)子的游离浓度。然而，在方法开发过程中需要考虑几个关键因素:

 
     该测试格式必须设计好，以避免潜在的空间位阻效应（steric hindrance）。一些双特异性分(fēn)子被设计為(wèi)靶向一个可(kě)溶性分(fēn)子和一个与细胞结合的分(fēn)子(细胞表面受體(tǐ))。这种双特异性分(fēn)子被明确设计為(wèi)与两个靶点同时相互作用(yòng)，以发挥其预期的药理(lǐ)活性。然而，双特异性分(fēn)子和检测试剂在检测环境中可(kě)能(néng)有(yǒu)不同的相互作用(yòng)，换句话说，在塑料容器表面可(kě)能(néng)表现出不同的相互作用(yòng)。因此，应该理(lǐ)解和谨慎的处理(lǐ)空间位阻效应。例如，从位阻效应研究中收集的数据，例如，在Octet平台上考查域结合干扰（domain binding interferences）的数据，可(kě)能(néng)指向选择一个特定的捕获和检测顺序，以避免不必要的空间位阻效应;


     一些双特异性分(fēn)子，通过协同作用(yòng)，具有(yǒu)很(hěn)高的药效學(xué)效力（highly pharmacologically potent），这可(kě)能(néng)意味着只需要非常低的临床剂量。因此, 基于已知的剂量-响应数据和剂量模型（dose modelling）的分(fēn)析方法灵敏度将会是一个重要的考量指标;


     与传统的单特异性抗體(tǐ)相比，双特异性分(fēn)子更有(yǒu)可(kě)能(néng)出现體(tǐ)内生物(wù)转化（biotransformation），即體(tǐ)内不稳定性（in vivo instability）。生物(wù)转化不仅可(kě)能(néng)影响双特异性分(fēn)子的活性，而且还可(kě)能(néng)影响定量双特异性分(fēn)子的可(kě)靠性。因此，完全中和性，anti-idiotypic抗體(tǐ)或靶标分(fēn)子(图3A)有(yǒu)可(kě)能(néng)允许检测潜在的生物(wù)转化（consequential biotransformation）;

    图3. 用(yòng)于定量双特异性分(fēn)子的不同测试格式和试剂。(A)完整分(fēn)子的测定方法：使用(yòng)靶标蛋白X和靶标蛋白Y作為(wèi)检测试剂，测定完整双特异性分(fēn)子的浓度。(B) 功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和靶标Y蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域Y的浓度。(C)功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和X靶标蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用(yòng)两种抗Fc抗體(tǐ)作為(wèi)测试试剂来测定双特异性分(fēn)子的所有(yǒu)可(kě)溶形式。

    与单特异性生物(wù)药分(fēn)子类似，如常规的单克隆抗體(tǐ)，ADA可(kě)以通过阻断捕获或检测试剂与药物(wù)的结合来干扰对双特异性分(fēn)子的定量(注意不要与改变的药物(wù)清除率相混淆)。此外，一个结构域可(kě)能(néng)是immunodominant；那么取决于测试格式，这可(kě)能(néng)会导致PK分(fēn)析结果的差异。另外，也许除了内源性的IgG4分(fēn)子之外，双特异性分(fēn)子所固有(yǒu)的新(xīn)颖，非天然结构，可(kě)能(néng)使双特异性分(fēn)子比单特异性分(fēn)子更容易诱发ADA反应，这是免疫原性风险评估的一个考虑因素。


功能(néng)域分(fēn)析（functional domain assay）


     功能(néng)域分(fēn)析是测定一个功能(néng)域的浓度，此格式可(kě)用(yòng)于展示相关的单一功能(néng)域的浓度。当双特异性的MOA使得药物(wù)分(fēn)子的一部分(fēn)（a partial molecule）保留部分(fēn)活性时(如可(kě)溶性靶标，融合蛋白，或肽激动剂)，这些检测显得尤為(wèi)重要。功能(néng)域分(fēn)析的目的是确定哪个功能(néng)域是有(yǒu)活性的，因此，可(kě)用(yòng)于解释与ADA的形成或生物(wù)转化相关的功能(néng)丧失。


     单域测试格式的设计如图3B和3C所示。该方法特意使用(yòng)药物(wù)靶标，或抑制性anti-idiotypic抗體(tǐ)来分(fēn)析双特异性分(fēn)子的游离结构域（free domain）， 并与抗Fc或抗框架（anti-framework）抗體(tǐ)，作為(wèi)捕获或检测试剂，联用(yòng)。这些分(fēn)析方法可(kě)用(yòng)于药物(wù)开发的任何阶段。有(yǒu)时，基于细胞的测试方法可(kě)以用(yòng)于测量单个功能(néng)域，如blinatumomab情况。


     图3. 用(yòng)于定量双特异性分(fēn)子的不同测试格式和试剂。(A)完整分(fēn)子的测定方法：使用(yòng)靶标蛋白X和靶标蛋白Y作為(wèi)检测试剂，测定完整双特异性分(fēn)子的浓度。(B) 功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和靶标Y蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域Y的浓度。(C)功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和X靶标蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用(yòng)两种抗Fc抗體(tǐ)作為(wèi)测试试剂来测定双特异性分(fēn)子的所有(yǒu)可(kě)溶形式。



总浓度分(fēn)析方法（total assay）

 
     总體(tǐ)测定法（total assay）用(yòng)于测定双特异性分(fēn)子的所有(yǒu)可(kě)溶形式。这种测试格式可(kě)用(yòng)于显示双特异性分(fēn)子的存在，而不考虑任何结构或功能(néng)的变化。该分(fēn)析方法通常用(yòng)于测定蛋白质的主（骨）干（backbone）结构，如Fc结构域。但这可(kě)能(néng)并不适用(yòng)于所有(yǒu)的构造；取决于构造的性质，也不一定适用(yòng)于所有(yǒu)的分(fēn)子变构體(tǐ)，例如，在临床研究中rhuMab双特异性药物(wù)。总體(tǐ)测定法应当耐受ADA和与靶标的结合（target binding）。图3D描述了总體(tǐ)测定法，其中两个与不同表位结合的抗人Fc抗體(tǐ)可(kě)以用(yòng)作捕获和检测试剂。


 
    图3. 用(yòng)于定量双特异性分(fēn)子的不同测试格式和试剂。(A)完整分(fēn)子的测定方法：使用(yòng)靶标蛋白X和靶标蛋白Y作為(wèi)检测试剂，测定完整双特异性分(fēn)子的浓度。(B) 功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和靶标Y蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域Y的浓度。(C)功能(néng)域分(fēn)析：采用(yòng)抗Fc抗體(tǐ)和X靶标蛋白作為(wèi)检测试剂来测量功能(néng)域X的浓度。(D)总浓度测定方法：通过使用(yòng)两种抗Fc抗體(tǐ)作為(wèi)测试试剂来测定双特异性分(fēn)子的所有(yǒu)可(kě)溶形式。




    同样，单一多(duō)克隆抗人IgG试剂也可(kě)用(yòng)作捕获和检测试剂。但此方法只用(yòng)于非临床研究。对于测量总體(tǐ)药物(wù)浓度， LC-MS非常有(yǒu)用(yòng)，特别是当没有(yǒu)特定的试剂可(kě)用(yòng)时。总體(tǐ)测定法可(kě)与“完整intact”或“有(yǒu)效active”药物(wù)测定法，结合使用(yòng)，或同时使用(yòng)两者，以评估體(tǐ)内外（in vivo /ex vivo）的稳定性，以及生物(wù)转化（biotransformation）对结构-功能(néng)关系的影响，例如，某些deamidation或氧化反应可(kě)能(néng)破坏药物(wù)与靶标的结合。

 
   PK样本中生物(wù)环境的复杂性為(wèi)使用(yòng)哪一种定量方法增加了另一层挑战。生物(wù)分(fēn)析方法的应用(yòng)是从药物(wù)发现和临床前安全性评估期间的动物(wù)研究开始的，持续到临床开发，并延伸到上市后的生命周期管理(lǐ)(即附加适应症和/或组合疗法)。正如前面所指出的，不同的分(fēn)析策略可(kě)以在不同的开发阶段使用(yòng)；当體(tǐ)内结构-功能(néng)关系确立之后，可(kě)以在药物(wù)发现和开发的整个过程中开发和使用(yòng)单一的定量分(fēn)析方法。但是，需要对分(fēn)析方法的生命周期管理(lǐ)有(yǒu)特殊考虑，以便将来自多(duō)个物(wù)种和不同目标患者群體(tǐ)的PK/PD知识整合到所探索适应症中去。

双特异性分(fēn)子的方法验证和认证（method validation & qualification）


    对双特异性分(fēn)子的方法验证和认证与其他(tā)大分(fēn)子一样，包括精密度和准确度，稀释線(xiàn)性度，选择性，干扰和特异性，以及稳定性测试，以确保数据的稳健性和完整性。然而，由于双特异性分(fēn)子的性质，如上所述，在开发完整分(fēn)子的分(fēn)析方法时，对这两个结构域的特异性和分(fēn)析干扰的评估都是必要的。

特别声明

    本文(wén)如有(yǒu)疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有(yǒu)引用(yòng)的原始信息和资料均来自已经发表學(xué)术期刊, 官方网络报道, 等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文(wén)献的选择考虑到多(duō)样化但也不可(kě)能(néng)完备。欢迎读者提供有(yǒu)价值的文(wén)献及其评估。

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