此前，“袁来如此”专栏就LBA定量方法的监管验证展开了第一、二期的详细介绍，本期将延续前两期的内容，继续分(fēn)享后续相关内容。

在方法开发之前或期间，应确定最低可(kě)接受的准确度和精密度，并在该分(fēn)析方法的生命周期内使用(yòng)，同时应用(yòng)适当的统计方法计算运行内和运行间的精密度（precision）和方法准确度（平均偏差mean bias）。表 VII A 中提供了适用(yòng)于方法开发和研究前验证数据计算的示例，表 VII B提供了相关公式。

表 VII A . 准确度和精密度的示例。重复多(duō)孔分(fēn)析的结果来自一个蛋白药物(wù)的免疫分(fēn)析数据。在Excel電(diàn)子表格中，使用(yòng)方差分(fēn)析（ANOVA）计算了相关统计结果。所有(yǒu)数据的符号表示法在表VII B中列出。

表 VII B.表VII A.中数字示例的符号表示法

运行内精密度：从计算的运行平均值，估算测定浓度值的混合运行内标准方差（SW）。总随机误差，通常称為(wèi)运行间精密度（或中间精密度intermediate precision），从所有(yǒu)运行的累积平均值，估算所有(yǒu)测定的浓度值的标准方差（）。如出现后一个标准方差稍微低估了真正的运行间的非精密度（imprecision），使用(yòng)方差分(fēn)析（ANOVA），则能(néng)够计算更准确的数值 （SIP）（见表VII A）。

方法的准确度（表示為(wèi)%RE）由加权样品平均值（weighted sample mean）与样品标称参考值μT（sample nominal reference value， 50ng/mL in表VII A）的百分(fēn)比偏差（percent deviation）确定。当所有(yǒu)分(fēn)析运行的重复孔数相同时，加权平均值（weighted mean）和样品总體(tǐ)平均值（ sample overall mean）相等，将标准方差除以样品标称值，即得出精密度，以%CV作单位记录。

在某些应用(yòng)场景中，例如当基质中存在内源性化合物(wù)且无法剔除时，则没有(yǒu)标称值可(kě)用(yòng)；因此，必须用(yòng)计算出的样本平均值替换%CV计算中的标称值。在这种情况下，在验证之前，还必须科(kē)學(xué)合理(lǐ)地计算回收率，并将其用(yòng)于评估准确度。

在方法开发的早期，可(kě)以计算校准品的%CV和平均RE，预测该分(fēn)析方法可(kě)能(néng)达到的精密度和准确性的最佳值。

要得到预期分(fēn)析性能(néng)更可(kě)靠的评估，可(kě)以独立制备额外的加标对照样本组，并至少进行3次分(fēn)析运行。所制备的样品的浓度应包括校准品的整个范围（例如，6至9个浓度点），对每次运行中的每个浓度点，至少进行复孔（duplicate）测定。由内插计算得出的样品浓度，将反映来自校准品的变异性、来自样品制备和位置等其他(tā)因素的变异性。表VI中所建议的每个浓度的累积 %CV和绝对平均RE（平均偏差mean bias）的目标限度為(wèi)20%（LLOQ為(wèi)25%），这与研究前验证评估时的精密度和准确性的目标限度相同。

在研究前验证期间，可(kě)通过分(fēn)析验证样品确认方法精密度和准确性。在预期未知样本的基质中，制备5个或更多(duō)浓度的验证样品如下：预期的定量下限（LLOQ）、小(xiǎo)于LLOQ的1/3的浓度、中浓度、高浓度和预期的定量上限（ULOQ），建议再进行最少6次分(fēn)析，对每次运行的每个样本至少进行2次独立分(fēn)析(复孔)。对于每个验证样品，应使用(yòng)适当的统计方法一起分(fēn)析所有(yǒu)运行的复孔测定值（请参阅表VII）。

如认為(wèi)方法可(kě)以接受，建议运行间精密度（%CV）和绝对平均偏差（%RE）均须 ≤20%（LLOQ 為(wèi)25%）。此外，建议将方法总误差（%CV和绝对%RE的总和）定為(wèi)≤30%（LLOQ為(wèi)40%），以符合研究中验证的接受标准。

每个研究中运行的精密度和准确性是通过评估QC样品的分(fēn)析结果来监控的。对于色谱类和LBA方法都采用(yòng)同样的运行接受标准：每个运行至少需要2/3的QC达到对应的标称参考值的特定百分(fēn)比（例如15%、20%、25%或 30%）；至少50%QC样品的分(fēn)析结果在指定的限度范围内。对于传统小(xiǎo)分(fēn)子药物(wù)的定量分(fēn)析，一般采用(yòng)4-6-15规则，相比之下，在2000年3月的AAPS研讨会上，建议对大分(fēn)子的LBA制定4-6-30规则，本文(wén)建议采用(yòng)4-6-30 规则。

建议采用(yòng)研究前验证部分(fēn)中描述的精密度和准确度的接受标准，因其计算简单，并与上述研究中的4-6-30 规则相当一致。根据定义，4-6-30 的接受标准仅基于单个定量结果与其标称值的偏差，而不是基于计算的平均值或标准方差，由于分(fēn)析结果与标称值的偏差包括随机误差和系统误差，因此它是一个总误差的度量（图4）。

图4. 定量分(fēn)析结果总误差（z）的说明。总误差定义為(wèi)分(fēn)析结果与其标称“真实”值 (μT)的偏差（deviation）。一般假定均匀样品的重复测定结果的误差服从钟形的正态分(fēn)布。為(wèi)便于比较，误差通常表示為(wèi)百分(fēn)比相对误差 (参见图中刻度)；计算方法是将偏差除以标称值，再乘以100。总误差等于系统误差的总和（systematic component，由计算出的分(fēn)析平均值与标称值的偏差来估计），再加上随机误差（random component，由一个分(fēn)析结果与分(fēn)析平均值的偏差来估计）。

附加的研究前验证的限制条件，即%CV和绝对%RE的总和≤30%，以防止接受具有(yǒu)高度不精密（imprecision）和高度偏差（bias）的分(fēn)析结果(例如接近20%)。这样的分(fēn)析方法往往不能(néng)通过4-6-30标准。其它确保研究前和研究中接受标准之间的一致性的统计方法亦可(kě)接受。

对于免疫测试和其它LBA方法，其定量范围应基于最低（LLOQ）和最高（ULOQ），满足目标精密度和准确度标准的验证样品，而不是校准品的性能(néng)。

用(yòng)于定义定量范围的验证样品是在未稀释的样本基质中制备的。在分(fēn)析之前，它们可(kě)能(néng)需要进行最低限度的稀释（minimal required dilution，MRD）。在需要使用(yòng) MRD 的情况下，可(kě)以将定量范围定义為(wèi)纯粹基质中的标准浓度值，或者定义為(wèi)应用(yòng) MRD 后获得的标准浓度值范围。例如在纯粹基质中，10至100 ng/mL 的校准曲線(xiàn)等效于应用(yòng)倍数為(wèi)10的MRD（即10%基质）之后，1到10 ng/mL的校准曲線(xiàn)范围。

在方法开发早期，可(kě)以使用(yòng)回算的标准品浓度值初步估计定量范围。稍后，则使用(yòng)加标样品来优化之前估计的定量范围。在此阶段，在预期的LLOQ和ULOQ浓度附近分(fēn)析更多(duō)浓度点是有(yǒu)益的。精度剖面图有(yǒu)助于评估定量范围的预期极限（图5）。

应根据外加待测物(wù)的验证样品（spiked validation sample）分(fēn)析结果的精密度和准确性来建立该分(fēn)析方法的定量范围。标准曲線(xiàn)应包括跨越预期的LLOQ和ULOQ的浓度。LLOQ 和 ULOQ 由最低和最高的验证样本决定，其精密度（运行间%CV）和准确度（绝对%RE）均≤20%（LLOQ為(wèi)25%），两者的总和≤30%。

在研究前验证时，确定的定量范围是在必要时，样本稀释后必须达到的范围。对高于ULOQ的样本，必须增加稀释的倍数后重新(xīn)分(fēn)析。如果样本已达到最低稀释要求，且低于最低定量限，则必须报告為(wèi)＜LLOQ。在样本分(fēn)析期间，如果对标准曲線(xiàn)的必要编辑导致没有(yǒu)标准品达到或低于经过验证的LLOQ，则必须提升LLOQ。在这种情况下，需要将LLOQ上调到其余标准品中的最低浓度。

在研究前的验证中，必须证明待测物(wù)在样本基质中的稳定性。稳定性试验应尽可(kě)能(néng)模拟研究样本的收集、储存和处理(lǐ)的条件。通常是将待测物(wù)添加到全血（whole blood）以及经过处理(lǐ)全血得到的基质，如通过血浆（plasma）和/或血清（serum）进行评估的。对制备和储存条件的评估，通常包括工作台稳定性（bench-top stability）、短期和長(cháng)期稳定性以及多(duō)个冻融循环的稳定性。在确定操作条件时，应考虑分(fēn)析物(wù)的理(lǐ)化性质，还必须建立待测物(wù)的初级标准溶液在相关存储条件下的稳定性。

稳定性样品必须与在与采集到的研究样本相同的基质中制备。如果使用(yòng)剥离或改变了的基质制备研究前校准样品和QC样品，则仍必须在未改变的基质中制备稳定性样品。在分(fēn)析方法开发过程中，制备稳定性样品对研究前验证期间的中、長(cháng)期稳定性数据的收集有(yǒu)极大的积极作用(yòng)。因此，在合适的实验室中尽早制备稳定性样品并保存相关文(wén)档记录，可(kě)以為(wèi)建立待测物(wù)的長(cháng)期稳定性提供一个良好的开端。稳定性评估可(kě)在方法开发过程中的样本处理(lǐ)阶段进行，包括但不限于对基质稳定性的评估：如室温、冻融循环等，以确定在分(fēn)析方法的整个生命周期中如何处理(lǐ)样品。

正式的稳定性评估必须在研究前验证中使用(yòng)已建立的分(fēn)析方法进行。制备稳定性样品时，必须将待测物(wù)加入到与研究样本相同的基质中，以产生高/低浓度的稳定性样品，这些浓度可(kě)以与高/低QC浓度相同。建议使用(yòng)与QC样品相同的重复孔数来分(fēn)析稳定性样品。

评估工作台稳定性时，要求处理(lǐ)样品的方法与样本收集（研究）和分(fēn)析现场的处理(lǐ)方法相同，并且应在室温(至少2小(xiǎo)时)和冰箱温度(2°至8°C)(至少24小(xiǎo)时)下进行。研究人员可(kě)将分(fēn)析物(wù)加入新(xīn)鲜采集的全血来评估其全血稳定性。

以评估全血待测物(wù)稳定性為(wèi)例，全血样品中加入分(fēn)析物(wù)，孵育2小(xiǎo)时，每隔一段时间进行样本处理(lǐ)以获得血浆或血清；之后，监测处理(lǐ)后样品的回收率的趋势来评估其稳定性。

对于冻融稳定性评价，应考虑在常规分(fēn)析中预期的冻融循环次数。标准的方法是3次冻融循环，每次解冻间隔不少于12小(xiǎo)时。冻结和解冻的速度和冷冻储存的温度应该模拟样品在分(fēn)析前解冻时的处理(lǐ)方式。评估長(cháng)期的稳定性必须考虑到样本在研究现场和测试设施的储存。在研究的整个生命周期中，包括研究样本的分(fēn)析完成之后，样本都必须是稳定的。测试的时间间隔则取决于研究的需要，对于非常長(cháng)期的研究，测试频次以比样本分(fēn)析更密集，以确保可(kě)以分(fēn)批次分(fēn)析样本，直到整个研究结束。

对于保存在-20°C和-70至-80°C样品是否需要进行稳定性进行研究，可(kě)能(néng)取决于样本在-20°C保存的时间。如果在-20°C冷冻样本，在-80°C储存，那么稳定性样品应该以同样的方式制备，在-20°C保存的时间可(kě)以建模，以预测其稳定性。

新(xīn)鲜制备的标准校准曲線(xiàn)和QC样品（无论是在可(kě)接受的失效期内或新(xīn)鲜制备的），可(kě)以作為(wèi)稳定样品的比较标准。除了全血稳定性外，稳定性的接受标准与用(yòng)于QC样品准确度和精密度的接受标准相同。如果稳定性样本的测定值在精密度的接受标准之内，那么样本就被认為(wèi)是稳定的，即便观察到稳定性变化的某种趋势，可(kě)以采用(yòng)其他(tā)评估方法，如使用(yòng)置信區(qū)间。在这种情况下，当观测到的稳定性样品的浓度或响应超出了置信區(qū)间的低端，则该样本不再有(yǒu)效。

通常在研究中验证期间，会继续进行稳定性评估。如果研究样品的处理(lǐ)和储存条件发生变化，则必须进行额外的稳定性评估，以反映新(xīn)的条件对稳定性的可(kě)能(néng)影响。如果无意中将样品储存在不同的温度下，则应该在样品分(fēn)析之前进行该温度下的稳定性研究，以确认稳定性，并通过更新(xīn)方法验证报告的形式进行书面體(tǐ)现。当一个时间点的稳定性数据表明样本失稳时，只要有(yǒu)一个预先建立的、确认稳定性趋势的方案, 则仍然可(kě)以在直到样品失稳的时间点以内的时间段进行样品分(fēn)析；如果下一个稳定性时间点的样本分(fēn)析，否决了之前的样本稳定性趋势， 则可(kě)以延長(cháng)样本的稳定性區(qū)间。

由于许多(duō)免疫测试方法性质或格式中的标准曲線(xiàn)定量范围(LLOQ到ULOQ)可(kě)能(néng)很(hěn)窄，有(yǒu)时甚至<1个数量级。因此，有(yǒu)必要证明，当待测物(wù)的浓度超出定量范围（高于ULOQ）时，可(kě)以稀释样本，使待测物(wù)的浓度进入经验证的定量范围。进行稀释实验的另一个原因是為(wèi)了识别可(kě)能(néng)存在的“prozone”或“钩状效应”(参见图6所示，即由高浓度待测物(wù)引起的信号抑制)。

稀释線(xiàn)性（dilutional linearity）不应与平行性（parallelism）相混淆。平行性必须使用(yòng)incurred sample，即已测样本再分(fēn)析的真实样本，进行评估，而稀释線(xiàn)性可(kě)以使用(yòng)外加待测物(wù)的QC样品进行评估。如果在研究前的验证中显示出稀释線(xiàn)性，那么在研究中验证时就不需要使用(yòng)系列稀释的QC样品了。

图6.钩状（Prozone）效应的演示。两个结合点EIA的典型S形浓度-响应曲線(xiàn)(●)，包括高浓度钩状效应。具體(tǐ)来说，高浓度的待测物(wù)产生了低于预期的响应。如果没有(yǒu)钩状效应，如开环(○)所示，较高的待测物(wù)浓度将产生 > ULOQ响应；如果没有(yǒu)钩状效应，曲線(xiàn)的量化范围在LLOQ和ULOQ之间。LLOQ和ULOQ之外的锚定点仅用(yòng)于曲線(xiàn)拟合。