上周，“袁来如此”专栏正式开篇，博济医药子公司深圳博瑞副总经理(lǐ)袁智博士以《大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析概论（一）：大分(fēn)子药物(wù)生物(wù)分(fēn)析的基础知识》為(wèi)题，梳理(lǐ)了大分(fēn)子药物(wù)分(fēn)析方法的基础概念。
本期开始，“袁来如此”专栏将就LBA定量方法的监管验证展开详细介绍，预计将有(yǒu)多(duō)篇重磅干货内容呈现，敬请垂注！
1992年，美國(guó)弗吉尼亚州水晶城，全球首个关于生物(wù)分(fēn)析方法验证会议召开，会议讨论共识的生物(wù)利用(yòng)度、生物(wù)等效性和药代动力學(xué)研究的生物(wù)分(fēn)析方法成為(wèi)了后来制药行业进行生物(wù)分(fēn)析方法验证的实际准则。史称水晶城会议。
水晶城会议还讨论了生物(wù)分(fēn)析方法验证的普遍问题，同时也承认了色谱和非色谱测试方法（包括免疫测试方法和微生物(wù)方法）之间存在差异。以水晶城会议為(wèi)基础，后续的行业会议和文(wén)献对生物(wù)分(fēn)析方法验证进行了多(duō)次讨论。
迄今為(wèi)止，人们最重视的是常规小(xiǎo)分(fēn)子药物(wù)的生物(wù)分(fēn)析方法的验证，其主要原因是自从1990年以来，作為(wèi)小(xiǎo)分(fēn)子药物(wù)的常规分(fēn)析工具——串联式液相色谱-质谱仪（LC-MS/MS）的使用(yòng)率在迅速地增長(cháng)。而大分(fēn)子的生物(wù)分(fēn)析方法亦对此借鉴颇多(duō)。
在本文(wén)中，LBA 是免疫测试方法（immunoassays）的同义词，指任何基于大分(fēn)子相互作用(yòng)进行定量分(fēn)析的方法；监管验证（regulatory validation）则是通过验证后方法所产生的分(fēn)析数据，可(kě)供生物(wù)药物(wù)的临床前毒理(lǐ)研究和临床申报、注册使用(yòng)。后续文(wén)章将详细解释监管验证与非监管验证之间的差异，敬请关注。
一个分(fēn)析方法的生命周期通常可(kě)分(fēn)為(wèi)3个阶段：方法开发（method development）、研究前验证（pre-study validation）和研究中验证（in-study validation）。方法开发是建立分(fēn)析方法的过程，而研究前验证是对分(fēn)析方法的确认，研究中验证则是在应用(yòng)过程中，如出现关键成分(fēn)发生变化后，进行的部分(fēn)验证。
為(wèi)了确保一个分(fēn)析方法能(néng)用(yòng)于大分(fēn)子定量，以支持药代动力學(xué)评估，并经得起监管审核，需要对特定分(fēn)析方法的各个组成部分(fēn)进行评估、验证和持续监控。因此，只要使用(yòng)该分(fēn)析方法，其验证就是一个持续的过程。
所以，方法验证是一个动态的过程。表1总结了需要评估的组分(fēn)和对于分(fēn)析方法生命周期中每个阶段的建议。本文(wén)的组织也对应于这些方法组分(fēn)，在相应的章节中，将讨论在不同阶段中可(kě)能(néng)开展的活动的更完整、详信的信息。
研究前验证阶段
研究中验证阶段
方法开发阶段
研究前验证阶段
研究中验证阶段
方法开发阶段
分(fēn)析方法的特异性将取决于所使用(yòng)的抗體(tǐ)或抗體(tǐ)对（antibody pair）的预先确定的特异性。抗體(tǐ)可(kě)以从商(shāng)业来源获得或内部生产。无论哪种情况，在选择之前都必须评估抗體(tǐ)结合特性的数据，评估分(fēn)析特异性的方法通常是分(fēn)析样本基质，样品基质+不同浓度的待测物(wù)及其变异體(tǐ)、物(wù)理(lǐ)化學(xué)上类似的化合物(wù)以及样品基质+可(kě)能(néng)与待测物(wù)共同使用(yòng)的化合物(wù)。
在某些情况下，可(kě)以使用(yòng)一个样本基质来评估特异性，该样本基质包含与體(tǐ)内浓度相当的一种或多(duō)种与待测物(wù)有(yǒu)关的化合物(wù)。通常，竞争式测试格式比夹心式测试格式更易受干扰物(wù)的干扰，因為(wèi)夹心式分(fēn)析方法使用(yòng)两种抗體(tǐ)，故具有(yǒu)更大的特异性。
如果无法获得待测物(wù)的变异體(tǐ)或相关形式，则可(kě)能(néng)无法在方法开发过程中生成交叉反应性（分(fēn)析特异性assay specificity）数据。因此，可(kě)能(néng)需要对经过验证的分(fēn)析方法的特异性进行回顾性评估，因為(wèi)随着时间的流逝，将产生更多(duō)有(yǒu)关待测物(wù)行為(wèi)的数据。
在方法开发过程中，评估选择性即是评估存在基质成分(fēn)时对待测物(wù)的定量。这些基质成分(fēn)可(kě)能(néng)会干扰抗體(tǐ)与待测物(wù)的结合，应当在定量下限（LLOQ，即低于低水平QC样品的浓度）或之上的附近外加待测物(wù)到同一样本基质类型的多(duō)个批次(至少10个)中，并评估相对误差的百分(fēn)比（%RE）。尽管选择性问题通常在定量范围的低端发生，也需要在较高待测物(wù)浓度下评估选择性。在背景干扰与浓度有(yǒu)关的情况下，必须确定在哪个待测物(wù)的浓度之下可(kě)能(néng)出现干扰。在方法验证之前，可(kě)能(néng)需要相应地提升最低的定量限。
研究前验证阶段
研究中验证阶段
本文(wén)如有(yǒu)疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有(yǒu)引用(yòng)的原始信息和资料均来自已经发表學(xué)术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文(wén)献的选择考虑到多(duō)样化但也不可(kě)能(néng)完备，欢迎读者提供有(yǒu)价值的文(wén)献及其评估。
8. 扩展阅读
袁来如此｜大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析概论（一）：大分(fēn)子药物(wù)生物(wù)分(fēn)析的基础知识
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