随着國(guó)家鼓励新(xīn)药研发、药品审评审批制度改革的快速推进，化药注册分(fēn)类、上市许可(kě)持有(yǒu)人制度等重磅政策的陆续出台，我國(guó)新(xīn)药研发迎来暖春。对于力图在创新(xīn)药领域深耕的从业者而言，如何洞悉全局，乘势而為(wèi)，或将成為(wèi)未来成败的关键。
為(wèi)此，广州博济医药微信公众号特邀生物(wù)分(fēn)析专家、博济医药子公司深圳博瑞副总经理(lǐ)袁智博士，开设“袁来如此”专栏，就大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析、药代动力學(xué)等相关话题展开专题研究，希望通过相关知识与经验的分(fēn)享，引发更多(duō)读者的讨论交流，加速振兴中國(guó)的生物(wù)医药产业发展，敬请垂注！
本文(wén)為(wèi)“袁来如此”专栏的第一篇，旨在根据已发表的文(wén)献资料，对与大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析相关的知识进行系统地介绍。
配體(tǐ)结合式测试方法（LBA，也称為(wèi)immunoassays）是一种常用(yòng)的分(fēn)析工具，用(yòng)于根据与其他(tā)生物(wù)分(fēn)子的相互结合作用(yòng)（binding interaction），定量测定生物(wù)分(fēn)子（目标分(fēn)析物(wù)，Analyte）在生物(wù)體(tǐ)液中的浓度。LBA要求至少使用(yòng)一个生物(wù)分(fēn)子来定量目标分(fēn)析物(wù)，这个生物(wù)分(fēn)子通常被称為(wèi)关键试剂，须能(néng)够特异性地结合目标分(fēn)析物(wù)。
LBA可(kě)分(fēn)為(wèi)两大类：（1）液相结合测试，其目标分(fēn)析物(wù)与标记过的检测试剂之间的结合反应发生在溶液相（图1A）；（2）固相结合测试，其中一个关键试剂被固定到固體(tǐ)表面，如微孔板或树脂（图1B），以捕获样本中的目标分(fēn)析物(wù)。液相测试通常需要分(fēn)离步骤，如色谱或電(diàn)泳或离心，从而将目标分(fēn)析物(wù)-标记检测试剂从未结合的分(fēn)子中分(fēn)离出来进行定量。
在应用(yòng)上，LBA是重要的评估生物(wù)药PK/TK时的主要定量分(fēn)析方法之一，该方法的特异性和选择性取决于目标分(fēn)析物(wù)与其他(tā)生物(wù)分(fēn)子（如受體(tǐ)、针对候选生物(wù)药的抗體(tǐ)和核酸适配體(tǐ)（aptamer））的相互作用(yòng)。
该方法中可(kě)观察到仪器响应与生物(wù)药的浓度间接相关，简言之，检测信号的来源是酶化學(xué)反应或放射化學(xué)反应，而这些反应则是各种相互结合作用(yòng)（binding interactions）的一部分(fēn)。
一般而言，大分(fēn)子的物(wù)理(lǐ)化學(xué)特性无法直接产生检测信号，不能(néng)用(yòng)于这样的定量分(fēn)析方法。主要原因在于这些binding interactions的内在性质，LBA的标（校）准曲線(xiàn)的动态（定量）范围比较狭窄，同时也是非線(xiàn)性，S型的（sigmoidal curve）。
如图1所示，在液相测试中，结合反应在溶液中发生，其中一个目标分(fēn)析物(wù)与标记过的检测试剂结合，然后再通过后续的分(fēn)离操作将目标分(fēn)析物(wù)-标记检测试剂从未结合的分(fēn)子中分(fēn)离出来。
在固相测试中，一个关键试剂被固定到固體(tǐ)表面，如微孔板或树脂，此试剂在固體(tǐ)表面结合目标分(fēn)析物(wù)，从而致使未结合的分(fēn)子被分(fēn)离出来。
Yalow和 Benson于1960年开发的测定人类胰岛素的方法，是放射免疫测定（RIA）的标志(zhì)性例子，Yalow因此于1977年获得诺贝尔奖。简单地说，就是通过用(yòng)鱼精蛋白锌牛胰岛素或商(shāng)业常规牛胰岛素免疫豚鼠，以获得作為(wèi)该RIA方法关键试剂的胰岛素结合抗體(tǐ)。
在这种方法中，由于缺乏人类胰岛素的结晶體(tǐ)，因此I131标记的结晶牛胰岛素（胰岛素-I131）被用(yòng)作示踪剂。此 RIA 的原理(lǐ)是基于样本中的人胰岛素与豚鼠血清中的胰岛素结合抗體(tǐ)的强力结合（图2中的步骤1），并让已知浓度的胰岛素-I131与该抗體(tǐ)的结合竞争（图2步骤2-3）。胰岛素-I131与胰岛素结合抗體(tǐ)的结合在溶液中进行，游离的胰岛素-I131与结合了抗體(tǐ)的胰岛素-I131的分(fēn)离通过纸色谱電(diàn)泳技术实现，这就使得定量测定胰岛素-I131成為(wèi)可(kě)能(néng)，其代表了样本中胰岛素的浓度。在此方法中，最低可(kě)定量的胰岛素浓度為(wèi)1.4μU。
在这个有(yǒu)里程碑意义的研究发表之后，RIA在20世纪后期得到了广泛的应用(yòng)。在使用(yòng)适当的关键试剂时，RIA灵敏度和选择性都极高，而其主要挑战包括使用(yòng)和处置放射性材料的许可(kě)证要求、放射性同位素的标记效率、成本及其有(yǒu)限的半衰期。在RIA得到应用(yòng)的十年内，即20世纪的70年代初，就出现了非同位素免疫测定，如酶免疫测定（enzyme immunoassays，EIA），EIA通常被称為(wèi)ELISA，即酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay）。
Engvall和Perlmann在1971年首次描述了一个定量兔免疫球蛋白G（兔IgG）的ELISA方法。其实质就是从羊血清中提取的抗兔IgG用(yòng)于结合兔子IgG，进而结合了一种碱性磷酸酶（ALP）的兔IgG被用(yòng)来与兔IgG相互竞争和抗兔IgG血清的结合，以此建立浓度与仪器响应（信号）之间的关系，生成的仪器信号与样本中的IgG量成反比。随着技术的不断发展，學(xué)界运用(yòng)了不同的酶，如辣根过氧化物(wù)酶（HRP）、β-半乳糖苷酶（GAL）和荧光素酶（luciferase），使得EIA具有(yǒu)与RIA相当的灵敏度。
图 2. Yalow最初发明的胰岛素放射免疫测定的原理(lǐ)图。样本中的胰岛素在溶液中与抗胰岛素血清结合（步骤1），然后把已知浓度的I131标记的牛胰岛素添加到反应溶液中（步骤2），样本中的胰岛素与I131标记的牛胰岛素（步骤3）相互竞争与抗體(tǐ)的结合。使用(yòng)人胰岛素制备的标准曲線(xiàn)以及胰岛素抗體(tǐ)结合的I131标记牛胰岛素的浓度可(kě)以计算样本中被置换的胰岛素的浓度。
竞争式ELISA格式是基于初始的胰岛素RIA和IgG EIA方法中的结合竞争。来自样品的目标分(fēn)析物(wù)（analyte）和参照分(fēn)析物(wù)（reference analyte）与分(fēn)析物(wù)特异性的抗體(tǐ)结合之间的竞争是这种格式的关键。
抗體(tǐ)或目标分(fēn)析物(wù)都可(kě)以标记酶，并用(yòng)于结合反应。使用(yòng)标记抗體(tǐ)（图3Ai）时，参照分(fēn)析物(wù)首先被动地吸附到微孔板的孔中，然后加入含有(yǒu)目标分(fēn)析物(wù)的样本，如细胞裂解液、血清等，并与固定浓度的标记抗體(tǐ)一起孵育。样本中的目标分(fēn)析物(wù)与固定的分(fēn)析物(wù)竞争，以结合有(yǒu)限数量的标记抗體(tǐ)，随后的酶反应产生的信号与样本中目标分(fēn)析物(wù)的浓度成反比。或者，可(kě)以使用(yòng)固相吸附的抗體(tǐ)和标记分(fēn)析物(wù)（图3Aii），样本中的目标分(fēn)析物(wù)与固定数量的标记分(fēn)析物(wù)共同孵育，并与之相互竞争和固定抗體(tǐ)的结合。与前面的示例中一样，生成的信号与样本中目标分(fēn)析物(wù)的浓度成反比。
直接式ELISA是最简单的ELISA格式，样品中的目标分(fēn)析物(wù)吸附到微孔板的孔中，通过酶偶联试剂或标记检测抗體(tǐ)，直接实现目标分(fēn)析物(wù)的检测，如图3B所示。
图3. 竞争式（Ai & Aii）、直接（B）和间接（C）ELISA测试格式的原理(lǐ)图。目标分(fēn)析物(wù)（Analyte）代表被测定的目标蛋白质。在竞争式ELISA中，可(kě)以标记目标分(fēn)析物(wù)或抗體(tǐ)，而在直接或间接ELISA格式中，只标记检测抗體(tǐ)。
间接ELISA类似于直接ELISA，两者间主要差别在于主要（primary）抗體(tǐ)未被标记。目标分(fēn)析物(wù)的检测是通过再次添加一个酶偶联试剂或标记检测抗體(tǐ)，使其与主要抗體(tǐ)结合而实现的，如图3C 所示。
直接ELISA更快速，因為(wèi)它比间接ELISA少一个步骤。它通常用(yòng)于需要快速完成的常规测试，商(shāng)业化的家用(yòng)怀孕测试就是这种格式的一个例子。而间接ELISA虽然较直接ELISA多(duō)一个步骤，但信号放大通常优于直接ELISA。因此，间接ELISA通常比直接ELISA更敏感，可(kě)以测量更低丰度的蛋白质。
正如图3C 所示，间接ELISA较直接ELISA增加的步骤正是来自于样本的目标分(fēn)析物(wù)直接吸附到微孔板，但想要达到这样的效果，亦有(yǒu)一定的难度。因為(wèi)在洗板步骤中，可(kě)能(néng)会洗掉目标分(fēn)析物(wù)，因此可(kě)能(néng)会增加测试的变异性。此外，非特异性地结合到微孔板的其它蛋白可(kě)能(néng)导致假阳性结果。為(wèi)了克服上述挑战，其它可(kě)靠性更高的格式进而衍生出来，其中有(yǒu)通常被称為(wèi)夹心、桥联或竞争性ELISA（在夹心或桥联ELISA格式中），在这些格式中，一种能(néng)与目标分(fēn)析物(wù)特异性结合的生物(wù)试剂首先被吸附到微孔板中。
图4. 夹心式ELISA（A）和桥接式（B）ELISA的原理(lǐ)图
夹心式ELISA需要两个不同的试剂或抗體(tǐ)，一个用(yòng)于捕获，另一个用(yòng)于检测目标分(fēn)析物(wù)。这些试剂与目标分(fēn)析物(wù)的不同表位（epitopes，结合位点）结合，从而形成夹心式格式（图4A），由此产生的相互作用(yòng)具有(yǒu)特别高的特异性（因為(wèi)捕获和检测步骤都需要特异的表位识别，才能(néng)生成检测信号）。
桥联ELISA常用(yòng)于测定具有(yǒu)两个相同抗原结合位点(2价)的抗體(tǐ)或其它目标分(fēn)析物(wù)的浓度，可(kě)以标记与捕获相同的试剂，用(yòng)于检测一个二价的目标分(fēn)析物(wù)，因此，目标分(fēn)析物(wù)可(kě)被视為(wèi)捕获和检测试剂之间的桥梁（图 4B）。夹心或桥接ELISA 格式均可(kě)设计成為(wèi)竞争式的ELISA。
上述格式是ELISA的基本设计，所有(yǒu)格式都可(kě)以使用(yòng)竞争或抑制条件加以调整，来测定抗原或抗體(tǐ)（图5），所有(yǒu)方法都要求与试剂预先反应/孵育才能(néng)达到最佳状态。这些最佳状态可(kě)以通过添加抗原（图5a）或抗體(tǐ)（图5b）来给予挑战。随着溶液中游离的抗原（抗體(tǐ)）的增加，能(néng)够与固定底物(wù)（immobilized substrate）结合的抗體(tǐ)（抗原）的数量则减少。洗涤步骤后，添加生色剂底物(wù)（chromophore substrate）以产生信号（颜色变化或发光）。抗體(tǐ)/抗原挑战引起的信号变化揭示了有(yǒu)关竞争性抗原/抗體(tǐ)的信息。竞争式ELISA对于测定复杂混合物(wù)中的抗原浓度相当有(yǒu)用(yòng)，特别是在可(kě)能(néng)含有(yǒu)抗原的未知样品与含有(yǒu)已知数量的纯化抗原的类似样品时。
免疫表位（epitope）是宿主免疫系统一般能(néng)够识别的抗原分(fēn)子的一部分(fēn)。当抗原的表位以非共价键的形式与其所诱导产生的抗體(tǐ)的确定互补性的區(qū)域（complementarity determining region）相互作用(yòng)时，就会发生特异性的识别。
抗體(tǐ)亲和力（affinity）表示抗體(tǐ)与其单一目标分(fēn)析物(wù)（analyte）/抗原（antigen）结合的烈度（intensity）或强度（strength），由解离常数（Kd）代表。低亲和力抗體(tǐ)与抗原结合弱，容易解离；而高亲和力抗體(tǐ)与抗原结合非常强，在多(duō)次的洗涤步骤中不易解离。从ELISA的角度来看，后者是首选，通常用(yòng)于捕获目标分(fēn)析物(wù)。
亲和度（Avidity）是衡量一个抗體(tǐ)与多(duō)个抗原决定因子（antigenic determinants）结合的整體(tǐ)强度的指标。抗體(tǐ)对某一个结合位点的亲和力并不总是能(néng)反映抗體(tǐ)-抗原相互作用(yòng)的强度，例如免疫球蛋白G（IgG）有(yǒu)两个抗原结合位点（2价），而IgM有(yǒu)10个抗原结合位点（10价），亲和度表示IgG或IgM的，分(fēn)别对于2个或10个抗原分(fēn)子的整體(tǐ)结合强度（overall strength）。
关键试剂
一个ELISA方法最重要的组成部分(fēn)是测试试剂，它决定了ELISA方法的灵敏度、特异性和方法的质量。ELISAs常用(yòng)于药物(wù)开发：在PK评估中，定量测定蛋白生物(wù)药的浓度；测定内源性蛋白和生物(wù)标志(zhì)物(wù)；检测抗药物(wù)抗體(tǐ)的存在以进行免疫原性评估等。LBA方法首选的关键试剂是单克隆抗體(tǐ)（MAbs）或多(duō)克隆抗體(tǐ)（PAbs），而不是重组靶标蛋白。為(wèi)了产生PAbs或MAbs，需要将生物(wù)药或生物(wù)标志(zhì)物(wù)蛋白及其佐剂或载體(tǐ)，根据相关应用(yòng)给到合适的宿主动物(wù)物(wù)种上进行免疫。对于PAbs，兔子、山(shān)羊和绵羊是最常用(yòng)的宿主物(wù)种，因為(wèi)它们的體(tǐ)型大（产生的抗體(tǐ)量也大），容易找到血管和强健的免疫反应。
用(yòng)于免疫的每一个抗原都是高度复杂的，因為(wèi)它可(kě)以呈现大量的，可(kě)以被不同的淋巴细胞识别的表位,这些淋巴细胞随后被激活。激活了的淋巴细胞增殖，分(fēn)化成浆细胞，并分(fēn)泌出多(duō)克隆抗體(tǐ)的混合體(tǐ)。PAb库（混合體(tǐ)）代表了不同抗體(tǐ)的集合群體(tǐ)，这些抗體(tǐ)可(kě)以识别抗原的多(duō)个表位(用(yòng)于ELISA分(fēn)析)。為(wèi)了生产MAbs，需要进一步分(fēn)离单个淋巴细胞，并与骨髓瘤细胞融合，以产生不死的杂交瘤细胞，从而持续产生特定的MAb。因此，同一个克隆（clone）的抗體(tǐ)只识别一个抗原的单个表位。在ELISA中会频繁使用(yòng)MAbs或PAbs，其选择（对于每种ELISA格式而言）取决于许多(duō)考虑因素：如可(kě)及性（Availability）、亲和力、特异性（Specificity）和交叉反应性（Cross-reactivity）。
抗體(tǐ)的特异性（specificity）是特异性地结合相关抗原的能(néng)力，与ELISA方法的选择性（selectivity）不尽相同，但相关。选择性是一个定量分(fēn)析方法，在其它潜在干扰成分(fēn)存在的情况下，从众多(duō)其它无关的蛋白质中鉴别和定量测定目标分(fēn)析物(wù)浓度的能(néng)力。交叉反应性（cross-reactivity）是指抗體(tǐ)与除目标抗原之外的其它多(duō)个抗原结合的能(néng)力。当抗原（目标分(fēn)析物(wù)）的与抗體(tǐ)试剂结合的表位与其它蛋白质相似时就会发生交叉反应。一般来说，特异性和交叉反应性对ELISA方法的选择性和基质效应有(yǒu)很(hěn)大影响。如果使用(yòng)高亲和力抗體(tǐ)作為(wèi)捕获试剂，抗體(tǐ)/目标分(fēn)析物(wù)的复合物(wù)就能(néng)够在含有(yǒu)多(duō)种蛋白质的“混合物(wù)”样品中有(yǒu)效地形成，基质效应会随之降低，而方法的选择性最终会得到提升。
表1总结了ELISA可(kě)能(néng)用(yòng)到的试剂和各种通用(yòng)或首选格式。
测试试剂的可(kě)及性可(kě)能(néng)因药物(wù)开发的不同阶段而异。在早期探索阶段，可(kě)能(néng)无法得到MAbs或PAbs，故常常选择重组生产的配體(tǐ)（即生物(wù)药的靶点）作為(wèi)关键试剂来测定游离的蛋白生物(wù)药(therapeutic protein，TP)的浓度。在早期临床前研究中，针对IgG Fc部分(fēn)的通用(yòng)抗體(tǐ)可(kě)用(yòng)于单克隆抗體(tǐ)药物(wù)，尽管仅能(néng)测定总浓度（结合靶标后的TP +游离的TPf）。
生物(wù)标志(zhì)物(wù)的定量分(fēn)析方法
各种體(tǐ)外诊断试剂盒在商(shāng)业上可(kě)用(yòng)于药物(wù)的早期发现阶段，也可(kě)从不同的供应商(shāng)获得各种重组蛋白和抗生物(wù)标记物(wù)蛋白的抗體(tǐ)。虽然生物(wù)标记物(wù)的定量分(fēn)析方法与PK方法相似，但这二者之间存在明显差别。与PK方法类似，生物(wù)标志(zhì)物(wù)的定量分(fēn)析方法可(kě)用(yòng)于测定目标基质中生物(wù)标志(zhì)物(wù)蛋白的游离浓度或总浓度。夹心式测试格式是主要选择，通常用(yòng)于测定生物(wù)标志(zhì)物(wù)蛋白的游离或总浓度。虽然当一个生物(wù)药具有(yǒu)抑制作用(yòng)时，需要测量游离的生物(wù)标志(zhì)物(wù)蛋白浓度，但开发测定游离的生物(wù)标志(zhì)物(wù)蛋白的方法有(yǒu)相当的挑战性，可(kě)能(néng)需要额外的分(fēn)离步骤。
人源化的或全人源的单克隆抗體(tǐ)或重组蛋白，作為(wèi)药物(wù)给予受试者/动物(wù)后，可(kě)诱导形成针对该生物(wù)药的抗體(tǐ)，特别是在临床前的动物(wù)试验中，这些由生物(wù)药诱导而形成的抗體(tǐ)通常被称為(wèi)抗药物(wù)抗體(tǐ)（ADA）。免疫检测方法是检测ADA是否存在于血清中的第一级检测。不同的ADA反应，如表位特异性（idiotype vs. nonidiotype，特异与非特异性）和数量（滴度或相对浓度），会影响对ADA和生物(wù)药的准确定量。由于ADAs会在血液循环中与生物(wù)药形成免疫复合物(wù)，高浓度的蛋白生物(wù)药能(néng)够干扰ADA的检测。
备注：idiotype：免疫球蛋白（如IgG）可(kě)变區(qū)域的分(fēn)子结构和构象，赋予其抗原特异性。
LBA测试方法在各种生物(wù)分(fēn)子的定量分(fēn)析方面拥有(yǒu)各种优势。它们在大多(duō)数平台（如比色计或平面電(diàn)化學(xué)发光）上，成本通常很(hěn)低。当高亲和力MAbs用(yòng)于LBAs时，LBA方法在检测和定量分(fēn)析存在于异质性的基质环境中的目标分(fēn)析物(wù)方面，具有(yǒu)高度灵敏度和特异性。出于研究目的，该类方法的灵敏度可(kě)以低至每毫升毫微微克的级别（femtogram/mL）。大多(duō)数LBAs的操作程序不涉及样品分(fēn)离的步骤，而基于LC-MS/MS的定量分(fēn)析方法则需要。当然，LBA也有(yǒu)几个缺点，与LC-MS/MS方法相比，LBA方法的动态范围较狭窄。虽然用(yòng)于基础研究的方法可(kě)以达到4-6个指数级的动态范围，但用(yòng)于规范性研究（regulated study）的验证过的方法，其定量范围往往仅為(wèi)2-3个指数级，这是因為(wèi)必须保持方法的稳健性和更好的重现性。
最重要的區(qū)别是，LBA的性能(néng)取决于所使用(yòng)试剂的质量和特异性。因此，试剂生成/选择（MAbs或PAbs）是方法开发过程中的关键步骤，这可(kě)能(néng)非常耗时，3到9个月不等。当使用(yòng)分(fēn)析物(wù)特异性的试剂来捕获目标分(fēn)析物(wù)时，这个缺点对LC-MS/MS方法也是存在的。从生物(wù)标志(zhì)物(wù)方法的角度来看，试剂的交叉反应可(kě)导致该方法的非特异性。因此，强烈建议进行额外的测试以阐明试剂的交叉反应性和非特异性。
本文(wén)概述了LBA测试方法，包括其主要概念的起源和演变，并且回顾了常用(yòng)的大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析方法的测试格式。最初的LBA测试方法诞生于1960年，是為(wèi)测定胰岛素而开发的放射免疫测试（radioimmunoassay），LBA测试方法的基础是至少有(yǒu)一种蛋白质与感兴趣的目标分(fēn)析物(wù)有(yǒu)相互作用(yòng)。在当今的实验室, 酶免疫测试（enzyme immunoassay）已在很(hěn)大程度上取代了放射性免疫测试，成為(wèi)了LBA测试方法的首选形式。
此外，本文(wén)还介绍了其它各种测试格式，如竞争式（competitive）、夹心式（sandwich）和桥接式（bridging），以及其所需的关键试剂。最后，简明扼要地讨论了LBA测试方法在蛋白质生物(wù)药开发中的应用(yòng)，以及与其它生物(wù)分(fēn)析平台的比较。
自上世纪60年代对胰岛素进行定量测定以来，基于与其它生物(wù)分(fēn)子结合作用(yòng)的LBA方法已被广泛地用(yòng)于生物(wù)分(fēn)子的定量分(fēn)析。例如，在蛋白质生物(wù)药开发过程中，这些方法為(wèi)定量分(fēn)析或检测蛋白质提供了一种准确和经济有(yǒu)效的方法。测试试剂（MAbs或PAbs）生成/选择是LBA方法开发过程中的关键步骤，一旦选择好了试剂，不同测试平台上的LBA方法能(néng)够提供显著节约时间和经济成本。
如前所述，另一个主要的大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析平台是液相色谱-质谱（LC-MS/MS）。在小(xiǎo)分(fēn)子药物(wù)的生物(wù)分(fēn)析中，LC-MS/MS方法是毋庸置疑的王者，在大分(fēn)子分(fēn)析中，LC-MS/MS的重要性也在不断地增加，特别是在与LBA方法以某种形式组合之后。可(kě)以肯定，生物(wù)分(fēn)析业界将继续探索LC-MS/MS在蛋白质药物(wù)的生物(wù)分(fēn)析中的应用(yòng)。生物(wù)分(fēn)析行业必须证明LC-MS/MS在药物(wù)开发的整个过程中，与LBA方法相比较，具有(yǒu)重现性（reproducibility）、可(kě)转移性（transferability）、可(kě)靠性（reliability）和成本效益（cost–effectiveness）等方面的显著优势。本系列后续将介绍相关知识，敬请关注。
本文(wén)来源：生物(wù)制药小(xiǎo)编
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