此前，“袁来如此”专栏根据已发表的文(wén)献资料，对PK定量方法的设计作初步介绍（袁来如此 | 大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析概论（十四_上）：LBA定量分(fēn)析双特异性生物(wù)药的挑战）。本期将延续上期内容，重点就相关案例分(fēn)析、复杂药物(wù)分(fēn)子的未来生物(wù)分(fēn)析技术以及前景等方面进行探讨。
“袁来如此”专栏系广州博济医药微信公众号打造的科(kē)普學(xué)术专栏，内容均為(wèi)博济医药药物(wù)研究中心资深科(kē)學(xué)顾问袁智博士原创。
案例分(fēn)析（Case studies）
以下案例研究是為(wèi)了说明对于双特异性分(fēn)子而言，生物(wù)分(fēn)析的独特考虑，其适用(yòng)于在药物(wù)开发的不同阶段设计和实施定量生物(wù)分(fēn)析和PK评估。
案例分(fēn)析1：在非临床研究中定量总和完整双特异性药物(wù)并评估ADA对PK的影响。
化合物(wù)X是一种基于支架的针对两种细胞因子的双特异性抗體(tǐ)。初步数据表明，这种特殊的支架产品平台可(kě)以在非临床物(wù)种中高频率地诱导免疫原性。為(wèi)了更好地解释ADAs存在时的毒理(lǐ)學(xué)发现，生物(wù)分(fēn)析小(xiǎo)组决定开发两种不同的PK方法来测定动物(wù)血清中的总药物(wù)和完整药物(wù)的浓度。总PK方法是使用(yòng)两种抗體(tǐ)对支架的框架进行分(fēn)析。完整的PK方法是使用(yòng)一种靶向细胞因子作為(wèi)捕获试剂，另一种作為(wèi)检测试剂。可(kě)以观察到，使用(yòng)两种PK方法分(fēn)析相同的样品产生的浓度与时间关系几乎完全等同，除了在较晚的时间点之外，药物(wù)浓度非常低的时候，即完整药物(wù)浓度略低于总药物(wù)浓度的时候。
在这些时间点观察到的低浓度差异只发生在少数受试者上。因此，ADA和生物(wù)转化（biotransformation）被认為(wèi)是最可(kě)能(néng)的根本原因。需进行一项研究以确定这种差异的根本原因，如生物(wù)转化诱导的不稳定性，靶标干扰（target interference）和ADA干扰。為(wèi)了验证这种双特异性分(fēn)子的體(tǐ)内生物(wù)转化，例如，蛋白质水解是否揭示了影响稳定性的结构缺陷，故开发了两种配體(tǐ)结合质谱(ligand-binding mass spectrometry，LBMS)方法，使用(yòng)抗人Fc免疫亲和捕获和靶目标捕获，然后进行分(fēn)层次的质谱分(fēn)析。采用(yòng)与ESI-MS相结合的纳米级液相色谱法对非多(duō)种代謝(xiè)产物(wù)进行了更高分(fēn)辨率的分(fēn)离和鉴定。
数据显示，生物(wù)转化的结果為(wèi)阴性。ADA分(fēn)析表明双特异性分(fēn)子比其母體(tǐ)药物(wù)的ADA出现频率更高。尽管随后通过免疫原性表征，证实大多(duō)数ADAs并非中和性ADAs，但发现ADAs有(yǒu)助于快速地清除完整药物(wù)。这些数据也可(kě)以解释為(wèi)当药物(wù)浓度足够低时，内源性细胞因子占据了特定的捕获/检测位点，即存在靶标干扰。结果表明，该药物(wù)在體(tǐ)内结构稳定。PK数据差异与完整药物(wù)的不稳定性无关，而更可(kě)能(néng)是由于ADAs高水平导致清除药物(wù)的速度更快。
案例分(fēn)析2：一个F(ab’)2在體(tǐ)内生物(wù)转化為(wèi)两个活性F(ab)单體(tǐ)的PK分(fēn)析。
本案例研究涉及一个双特异性F(ab’)2，由一个anti-VEGF arm和一个anti-Ang2 arm组成，用(yòng)于玻璃體(tǐ)内注射（intravitreal administration）治疗视网膜变性疾病，如湿性老年性黄斑变性和糖尿病性黄斑水肿。据报道，针对F(ab’)2抗體(tǐ)铰链區(qū)的，先前存在的内源性抗體(tǐ)(PEA)存在于很(hěn)大比例的人群中。在未接受药物(wù)的食蟹猴和人血清样本中，都证实了这一点。移除这些预先存在的内源性抗體(tǐ)的铰链表位（hinge epitopes）使得该分(fēn)子中只有(yǒu)单个二硫键将两个fab结合在一起。
因此，注射入玻璃體(tǐ)（其含有(yǒu)glutathione作為(wèi)抗氧化产品的一部分(fēn)，以保证晶状體(tǐ)的完整性）后，药物(wù)分(fēn)子生物(wù)转化為(wèi)individual Fabs，相关清除率(t1/2 <1天)，通常比兔玻璃體(tǐ)的Fab (t1/2 约3天)或F(ab’)2 (t1/2 约3天)的清除率要大(未发表的观察结果)。
备注：一般情况下，t1/2与清除率的关系如下，即半衰期还取决于药物(wù)分(fēn)布體(tǐ)积；如果假设分(fēn)布體(tǐ)积恒定，则t1/2与清除率之间的关系是确定成反比的：
因此，完整的F(ab’)2和individual Fab碎片均存在于眼腔(玻璃體(tǐ)和水相之中)和系统循环之中。正如所预料的，啮齿类动物(wù)脉络膜新(xīn)生血管模型（rodent choroidal neovascularization models）显示，individual Fabs保留了生物(wù)活性。為(wèi)了全面地描述活性药物(wù)暴露量的特征，有(yǒu)必要定量这3种药物(wù)形式。因此，开发并验证了3种单独的PK定量方法。此前有(yǒu)學(xué)者曾经考虑过使用(yòng)一种总PK定量方法来测定所有(yǒu)这3种形式。但是，该分(fēn)子是一个新(xīn)颖结构，故有(yǒu)必要阐明其生物(wù)转化的动力學(xué)，这对于描述该分(fēn)子體(tǐ)内的行為(wèi)是很(hěn)重要的。
定量完整待测物(wù)的ELISA方法使用(yòng)固定的（immobilized）重组蛋白Ang2捕获待测物(wù)，然后加入biotin-VEGF，最后加入streptavidin-HRP，是一个sequential sandwich格式。外加待测物(wù)的回收率实验证明这种测试格式仅能(néng)够特异性地检测F(ab’)2，但检测不到两种Fab分(fēn)子中的任何一个。定量两个Fab分(fēn)子的方法都采纳类似的基本格式：使用(yòng)各自的靶标-Ang2或靶标-VEGF，从样本中捕获Fabs。然后加入biotin-sheep antihuman IgG的重链和轻链(H&L)，最后，加入streptavidin-HRP进行检测。
值得注意的是，采用(yòng)测定Fab的格式，也可(kě)以检测到完整分(fēn)子。尽管使用(yòng)Fabs作為(wèi)标准品（standards）和对照品（controls），在分(fēn)析Fab时，也定量了完整F(ab’)2。此外，使用(yòng)F(ab’)2和任何一个Fab的混合物(wù)，可(kě)以通过从完整分(fēn)子（高特异性）的定量结果中减去Fab结果来定量另一个Fab。已经验证了所有(yǒu)这些分(fēn)析方法，并用(yòng)于兔血清样本的非临床研究，也认证了这些方法可(kě)用(yòng)于食蟹猴的血清和水/玻璃體(tǐ)/视网膜的萃取物(wù)中药物(wù)的定量。血清定量分(fēn)析的另一个挑战是几个ng/ml甚至更低的药物(wù)浓度，这也是玻璃體(tǐ)腔生物(wù)药给药的一致特点：给药量很(hěn)小(xiǎo)(通常是<1 mg/eye)；药物(wù)在到达系统循环时，经历了高倍数的稀释。
案例分(fēn)析3：在非临床研究中监测體(tǐ)内双特异性药物(wù)生物(wù)转化的总和活性（total and active）药物(wù)的定量。
一个针对肿瘤适应症的双特异性单克隆抗體(tǐ)靶向两个细胞表面的抗原，其药理(lǐ)作用(yòng)取决于单克隆抗體(tǐ)的两个结合臂（both binding arms）的完整。然而，在體(tǐ)外生物(wù)物(wù)理(lǐ)表征过程中，在其中一个结合臂中发现了翻译后修饰(post-translational modification，PTM)的问题。但这种PTM，不能(néng)在不显著损害生物(wù)活性的情况下，通过蛋白质工程而排除，因為(wèi)在不稳定的氨基酸上的点突变（point mutation）会完全破坏单抗与靶标的结合。此外，仅具有(yǒu)第二个结合臂功能(néng)的药物(wù)变异體(tǐ)的累积，可(kě)能(néng)会屏蔽活性药物(wù)结合第二个靶点，并可(kě)能(néng)在多(duō)次给药后诱发毒性反应。
对该单抗體(tǐ)内生物(wù)转化的特征进行研究是势在必行的，如转化的动力學(xué)和程度，这可(kě)以為(wèi)进一步开发该单抗提供指导。随后，使用(yòng)与分(fēn)子的Fc部分(fēn)特异性结合的测试试剂开发了一个桥接格式的总药物(wù)PK定量方法，辅之以一种活性药物(wù)PK定量方法：即使用(yòng)靶标蛋白作為(wèi)PTM-liable functional domain的捕获试剂，使用(yòng)抗人Fc试剂作為(wèi)检测试剂。利用(yòng)野生型和拥有(yǒu)点突变的药物(wù)的混合比例，活性PK方法，在总药物(wù)存在的情况下，能(néng)够區(qū)分(fēn)和准确测定活性药物(wù)的百分(fēn)比。之后，评估了该药物(wù)分(fēn)子在食蟹猴上的PK特性。使用(yòng)了总和活性PK定量方法来测定研究样本中总和活性药物(wù)的浓度。实验数据证实，體(tǐ)内样品中的药物(wù)出现了PTM，并且活性药物(wù)浓度百分(fēn)比随时间而降低。基于建模和仿真，可(kě)以在临床研究中减少剂量间隔来减轻活性药物(wù)浓度的降低。非临床研究结果有(yǒu)助于决定使用(yòng)活性PK定量方法作為(wèi)支持临床研究的主要方法。而在FIH研究中，总PK定量方法可(kě)用(yòng)于进一步描述无活性药物(wù)变异體(tǐ)（inactive drug variants）潜在的累积及其对PK/PD和毒性的影响。
复杂药物(wù)分(fēn)子的未来生物(wù)分(fēn)析技术
如表1中所总结的，一般需要多(duō)种PK定量方法和ADA方法评估ADC和双特异性抗體(tǐ)的基础药代动力學(xué)和免疫原性。分(fēn)析方法数量的增加给样本的收集、储存、运输、分(fēn)析和分(fēn)析方法的生命周期管理(lǐ)带来了巨大的负担。在某些情况下，由于样本数量有(yǒu)限，根本不可(kě)能(néng)进行多(duō)次分(fēn)析。对于增加的功能(néng)域和潜在的生物(wù)转化，仅仅增加分(fēn)析方法的数量以满足生物(wù)分(fēn)析需求似乎是一个直接的解决方案，但“两点式two-point”结合方法（如夹心式LBA）并不适合评估具有(yǒu)多(duō)域（>3）构造的分(fēn)子“完整性intactness”。尽管免疫捕获（IC-）-LC-MS/MS方法在理(lǐ)论上可(kě)以识别来自多(duō)个功能(néng)域的特征肽，但有(yǒu)关“完整性”和功能(néng)的信息仍然缺失。因此，随着复杂药物(wù)模式（complex drug modalities）的生物(wù)转化越来越受到的关注，定量LBA方法和（IC-）LC-MS/MS方法往往无法对潜在的生物(wù)转化提供相关信息。正如CovX-Body和基于框架（scaffold-based）的双特异性抗體(tǐ)的案例所表明的那样，PK行為(wèi)的意外不一致触发了潜在生物(wù)转化的嫌疑，进而就需要新(xīn)的分(fēn)析方法来进一步研究。
表1.ADC和双特异性抗體(tǐ)的PK定量方法（SCR，标准曲線(xiàn)范围；ECL，電(diàn)化學(xué)发光；N.A.，不适用(yòng)）
备注：表格中参考文(wén)献的标注不适用(yòng)。
因此，使用(yòng)multiplexed PK/ADA方法以测定完整药物(wù)、各种变构體(tǐ)（variants）和相关的ADA是非常需要的，同时，也对潜在的生物(wù)转化提供相关信息。Multiplexed检测方法已在联合疗法中有(yǒu)早期应用(yòng)，但尚未看到对复杂药物(wù)模式“biotransformation ready”的multiplexed测试方法，用(yòng)以帮助评估复杂药物(wù)的完整性，表征各种生物(wù)转化，并测试对药物(wù)/药物(wù)变构體(tǐ)各部分(fēn)的免疫反应。下文(wén)将简单介绍对复杂药物(wù)模式有(yǒu)希望的两项生物(wù)分(fēn)析技术：HR-MS定量分(fēn)析完整蛋白质和毛细管Western Blot定量分(fēn)析。
HR-MS 定量分(fēn)析完整蛋白质
与针对完整药物(wù)分(fēn)子中某个选定區(qū)域的LBA和LC-MS/MS技术相比，完整蛋白质的定量分(fēn)析旨在将一个复杂的药物(wù)分(fēn)子作為(wèi)一个整體(tǐ)来研究，这能(néng)够揭示重要的高层次结构和生物(wù)转化的相关信息。完整蛋白的LC-MS分(fēn)析通常用(yòng)作对生物(wù)转化研究的定性分(fēn)析。Murphy等人使用(yòng)IC-LC Q-ToF MS，在CovX-Body双特异性抗體(tǐ)上发现并鉴别了蛋白酶剪切掉的含有(yǒu)8个氨基酸的肽段。He等人利用(yòng)高分(fēn)辨率的QTOF-MS与IC-LC相结合，成功地在小(xiǎo)鼠血浆中，鉴别了若干不同DARs的ADC和生物(wù)转化了的变异體(tǐ)（biotransformed variants，由于增加/删除了hexose, glutathione, cysteine以及linker-drug）。近年来，HR-MS在灵敏度和质量分(fēn)辨率方面的提高，逐渐使其在定量生物(wù)分(fēn)析中得以有(yǒu)更广泛的应用(yòng)。
Jian等人建立了IC-LC-QTOF-MS的工作流程，用(yòng)于小(xiǎo)鼠血浆中人类mAbs的绝对定量。定量的下限（LLOQ）為(wèi)1000ng/mL（20 L血浆样品），并可(kě)降至250ng/mL，如果使用(yòng)200L样品。在优化其数据处理(lǐ)策略后，LLOQ降至50ng/mL。使用(yòng)所述工作流程，Jian等人随后展示了GLP1-Fc融合蛋白的定量；同时，在对小(xiǎo)鼠的研究过程中，识别了该药物(wù)的两种主要蛋白酶降解产物(wù)。
Lanshoeft等人验证了基于multiplex IC-LC-HRMS的PK定量方法，并用(yòng)于非临床PK研究，该方法同时定量分(fēn)析了大鼠血清中两个人类IgG1。类似地，Jin等人在大鼠血清中定量了完整的trastuzumab emtansine（一种ADC）及其主要的DAR物(wù)种，其定量下限值约為(wèi)20ng/mL，線(xiàn)性动态范围為(wèi)5-100g/mL。
另一个有(yǒu)趣的应用(yòng)是最近Zhang等人报道的，在非变性LC条件下对native intact mAb进行的定量分(fēn)析，这可(kě)能(néng)為(wèi)使用(yòng)LC-HR-MS技术以multiplex的方式建立结合（bound）/未结合（unbound）PK定量方法以及其它各种功能(néng)域PK的定量方法提供了机会。
毛细管Western Blot定量分(fēn)析方法
毛细管Western blot，也称為(wèi)毛细管纳米免疫测定（capillary nanoimmunoassay，CNIA），已由制造商(shāng)Protein Simple(San Jose, CA)商(shāng)业化的Simple Western system，是指毛细管電(diàn)泳免疫测定系统，它提供基于蛋白质大小(xiǎo)和電(diàn)荷的分(fēn)离格式。与在分(fēn)离和检测之前进行配體(tǐ)结合的IC-LC-MS技术不同，Western blot首先分(fēn)离蛋白质，然后使用(yòng)配體(tǐ)结合作為(wèi)检测方法。因此，它能(néng)够使用(yòng)multiplexed immunoassay，同时检测完整的蛋白质及其生物(wù)转化的产物(wù)，并对变异的各种功能(néng)域进行表征。
目前，毛细管Western Blot定量分(fēn)析在蛋白质药物(wù)的PK研究中应用(yòng)仍然有(yǒu)限。Li等人在小(xiǎo)鼠研究中验证了无浓缩的PK方法，以定量小(xiǎo)鼠血浆中的polyhistidine N-和FLAG C-terminally-tagged重组蛋白（约55kDa），其LLOQ為(wèi)20ng/mL。Anti-FLAG tag抗體(tǐ)在immunoblot步骤中用(yòng)作初级抗體(tǐ)。研究发现，只需以1:100至1:500的比例稀释样品，即可(kě)消除基质中高丰度蛋白的干扰。
此外，Kodani等人使用(yòng)capillary western blot检测到丙型肝炎病毒（HCV）的IgG抗體(tǐ)，表明其在抗药物(wù)抗體(tǐ)（ADA）检测方面的潜在应用(yòng)。重组HCV蛋白首先在毛细管中分(fēn)离和固定。稀释的人类血清随后在毛细管中孵育，使抗HCV抗體(tǐ)与固定的抗原结合。这一步骤之后，使用(yòng)抗人类IgG-HRP抗體(tǐ)再进行第二次孵育。在70个特表征良好的人血清样本的检测中，该方法与另一种市售的抗HCV抗體(tǐ)测试方法的相关性良好。
结论
為(wèi)了解决双特异性分(fēn)子开发过程中所需的生物(wù)分(fēn)析支持，本文(wén)讨论了在开发这些药物(wù)分(fēn)子的PK分(fēn)析策略时一些独特的考虑。本文(wén)提出的策略和方法可(kě)以应用(yòng)于双特异性分(fēn)子和其它多(duō)域大分(fēn)子药物(wù)，这需要对特定的药物(wù)分(fēn)子其作用(yòng)机制（MOA）和潜在的靶标生物(wù)學(xué)，以及评估PK/PD的所需要的数据有(yǒu)全面的了解。
大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析行业需要新(xīn)的定量分(fēn)析技术来开发multiplexed PK定量方法，以便定量复杂模式的药物(wù)及其生物(wù)转化产物(wù)。用(yòng)于完整蛋白质分(fēn)析的（IC-）LC-HR-MS和capillary Western blot技术拥有(yǒu)很(hěn)大应用(yòng)前景，因其multiplexibility和提供目标待测物(wù)的多(duō)维信息（如分(fēn)子量等電(diàn)点和域功能(néng)/domain functionality）的能(néng)力。在过去几年中， HR-MS和capillary Western blot platforms的定量灵敏度有(yǒu)了显著改善，尽管这些技术仍需要进一步改善，以获得更广泛的接受。当前HR-MS系统的一般操作相对简单，但HR-MS（以及capillary Western blot）的数据分(fēn)析、解释和验证，从监管的角度看，还需要进一步明确。
从理(lǐ)想的和雄心勃勃的角度思考，最好将PK/PD/免疫原性/生物(wù)转化的生物(wù)分(fēn)析整合到一个分(fēn)析测试方法之中，以减少药物(wù)开发所需的资源，并促进在同一组患者样本中全面阐明药物(wù)的PK/PD行為(wèi)。设计和开发这样的定量分(fēn)析的方法，对每一种生物(wù)药结构都是独特的，需要一种彻底的“适合其用(yòng)途”的方法及其确认（confirmation）。為(wèi)双（多(duō)）特异性分(fēn)子开发可(kě)靠、稳健和可(kě)重现的PK分(fēn)析方法是非常具有(yǒu)挑战性的，因為(wèi)多(duō)种因素会影响准确（accurate）而有(yǒu)意义（meaningful）的浓度测定值。未来生物(wù)分(fēn)析行业和监管机构对指导定量分(fēn)析这些高度复杂的生物(wù)（蛋白）药的最佳做法的讨论和意见，将会极具价值。
未来前景
随着生物(wù)分(fēn)析方法的特异性、选择性和灵敏度的不断提高，更准确（accurate）和更精密（precise）的测定双特异性抗體(tǐ)浓度和评估其在生物(wù)样品中的免疫原性将成為(wèi)可(kě)能(néng)。预计双特异性和多(duō)特异性生物(wù)药的数量和种类将继续扩大，这将促进新(xīn)的生物(wù)分(fēn)析方法的开发，以适应这些分(fēn)子的结构复杂性和MOAs。
当然，目前的方法将被用(yòng)于新(xīn)的蛋白药物(wù)的定量。尽管LBA方法是目前生物(wù)分(fēn)析方法的首要选择，并且在可(kě)以预见的未来仍将如此，LC-MS/MS方法，由于其与生俱来的multiplexed的定量分(fēn)析能(néng)力，可(kě)能(néng)会得到更加广泛地应用(yòng)，以支持双特异性生物(wù)药的PK评估。LC-MS/MS比LBA分(fēn)析具有(yǒu)更少的分(fēn)析变异性（variability）和关键试剂的可(kě)及性（availability）问题。预期分(fēn)析实验室的自动化将扩展到生物(wù)分(fēn)析的所有(yǒu)阶段，以减少人工错误和提高数据质量。
特别声明
本文(wén)如有(yǒu)疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有(yǒu)引用(yòng)的原始信息和资料均来自已经发表學(xué)术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。参考文(wén)献的选择考虑到多(duō)样化但也不可(kě)能(néng)完备。欢迎读者提供有(yǒu)价值的文(wén)献及其评估。
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博济医药拥有(yǒu)一支规模庞大、专业成熟的临床研究队伍，可(kě)提供包括医學(xué)、项目管理(lǐ)、监查、稽查、数据管理(lǐ)和统计分(fēn)析、生物(wù)样本检测在内的临床试验全流程解决方案。截至2020年，博济医药服務(wù)的客户超1000家，完成800多(duō)项临床试验项目，助力客户获得新(xīn)药证书60多(duō)项、生产批件超过80项。拥有(yǒu)丰富的临床试验服務(wù)经验，服務(wù)项目涵盖临床研究各个领域，在肿瘤、肝病、消化等创新(xīn)药领域拥有(yǒu)独特的临床服務(wù)體(tǐ)系。
博济医药在全國(guó)设有(yǒu)40多(duō)个临床监查网点，与全國(guó)近600个临床试验机构展开合作，并运用(yòng)ORACLE OC/RDC及CTMS系统，控制临床数据采集的及时性、管理(lǐ)临床试验过程的规范性。
