上周，“袁来如此”专栏就药物(wù)开发过程中如何缓解或消除对LBA定量分(fēn)析方法干扰的策略展开了详细介绍(袁来如此｜大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析概论（六）上：LBA定量抗體(tǐ)药物(wù)的背景干扰及其消除)，本期将延续上期内容，重点关注抗體(tǐ)生物(wù)药的定量分(fēn)析。
“袁来如此”专栏系广州博济医药微信公众号打造的科(kē)普學(xué)术专栏，内容均為(wèi)博济医药子公司深圳博瑞副总经理(lǐ)袁智博士原创。
LBA测试方法常用(yòng)于定量生物(wù)基质中抗體(tǐ)药物(wù)的浓度，根据测试格式的不同，LBA可(kě)以测定游离药物(wù)的浓度或药物(wù)总量。游离药物(wù)是指不与靶点结合的治疗性抗體(tǐ)。药物(wù)总量则指游离的加上结合了靶标的药物(wù)。由于PK数据至关重要，相关监管指南和行业共识都对定量方法的验证提出了相关建议，包括应对干扰的一些方面。
游离的抗體(tǐ)药物(wù)的测定通常使用(yòng)抗原或中和性抗独特型抗體(tǐ)(anti-ID)作為(wèi)捕获抗體(tǐ)。检测抗體(tǐ)可(kě)以是中和性anti-ID、非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗體(tǐ)（如抗人IgG2特异性抗體(tǐ)）或抗药物(wù)抗體(tǐ)的框架突变（anti-framework mutations）的抗體(tǐ)。抗體(tǐ)药物(wù)总量可(kě)被非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗體(tǐ)或抗药物(wù)抗體(tǐ)的框架突变的抗體(tǐ)捕获和检测。但是，很(hěn)少能(néng)得到非中和性anti-IDs，因為(wèi)在大多(duō)数情况下，生产anti-IDs时会产生很(hěn)多(duō)中和性anti-IDs，但非中和性anti-IDs的产生量却很(hěn)少。
游离抗體(tǐ)药物(wù)的定量在技术上是具有(yǒu)挑战性的，特别是当可(kě)溶性靶标在样本中处于高水平时，许多(duō)基质成分(fēn)可(kě)以显著改变可(kě)溶性靶标的水平或影响药物(wù)与可(kě)溶性靶标的结合，从而引起游离药物(wù)浓度的变化。此外，这些成分(fēn)也很(hěn)有(yǒu)可(kě)能(néng)对之前所讨论的可(kě)溶性靶标定量起到干扰。
在定量分(fēn)析抗體(tǐ)-药物(wù)偶联物(wù)(ADCs)时，样本的制备具有(yǒu)特殊意义，因為(wèi)ADCs可(kě)以在采集的样本中或體(tǐ)内发生生物(wù)转化，使本已复杂的ADC生物(wù)分(fēn)析更加复杂化。
即使是单克隆抗體(tǐ)的定量也会受到样本制备方法的影响。例如，使用(yòng)EDTA作為(wèi)抗凝剂会螯合阳离子（如Ca2+和Mg2+），从而影响游离抗體(tǐ)药物(wù)浓度的准确测定，如果这些阳离子是药物(wù)与靶标结合所必需的。
在样本收集和制备过程中，不理(lǐ)想的程序（如上半篇提到的生物(wù)标志(zhì)物(wù)部分(fēn)所讨论的）会从细胞中释放可(kě)溶性靶标，导致样本中靶标的浓度人為(wèi)地升高，从而低估了游离抗體(tǐ)的浓度。
為(wèi)了减少这些潜在的干扰，在对每个抗體(tǐ)药物(wù)进行分(fēn)析时，都应该优化样本采集程序和检测条件。正如前文(wén)所提到的，制备血清的过程可(kě)释放储存在血小(xiǎo)板中的蛋白质，而使用(yòng)血浆则可(kě)避免它的释放。此外，可(kě)以实施样本增稳的条件，如低温，可(kě)以减少在样本收集过程中蛋白质从细胞中释放出来的量。在检测试剂存在的情况下先进行样本酸解处理(lǐ)，再进行中和处理(lǐ)，或在检测过程中保持样本的弱酸性，该方法已被证明可(kě)以有(yǒu)效地减少来自靶标的干扰。
对于游离抗體(tǐ)药物(wù)的分(fēn)析，应该优化检测条件，如孵育时间、捕获试剂的浓度和最低稀释要求，以最大限度地减少药物(wù)从它的靶标解离。这对与其靶标亲和力较低、在血液循环中可(kě)溶性靶标浓度较高的抗體(tǐ)药物(wù)，尤為(wèi)重要。因此，需要在研究人群中评估稀释線(xiàn)性度和样本稳定性，以将靶标水平的变化对游离药物(wù)定量的准确性这一影响纳入考虑。
当使用(yòng)抗原捕获待测物(wù)时，高浓度的结合蛋白或可(kě)溶性受體(tǐ)（soluble receptor）可(kě)能(néng)会饱和捕获试剂，致使游离药物(wù)的浓度被低估。使用(yòng)中和性anti-ID，而不是药物(wù)靶标，作為(wèi)捕获试剂，则可(kě)以最大限度的减少这个问题。
样本中的ADA是基质干扰的一个来源。ADA与捕获抗體(tǐ)（或在均相测试方法中的检测抗體(tǐ)），结合到抗體(tǐ)药物(wù)上，这一竞争会低估抗體(tǐ)药物(wù)的浓度；非竞争性ADA可(kě)使抗體(tǐ)药物(wù)分(fēn)子交联形成大體(tǐ)量的复合物(wù)，这也会影响药物(wù)浓度测定的准确性。通过对PK、PD和ADA的结果进行比较，可(kě)以验证研究中是否存在这种干扰，从而相应地解释相关数据。
与生物(wù)标记物(wù)测定相似，基质中的heterophilic抗體(tǐ)和人抗动物(wù)抗體(tǐ)是免疫测试中的常见干扰来源，可(kě)以用(yòng)前述相同的方法来减轻干扰的影响。如果使用(yòng)抗人抗體(tǐ)作為(wèi)捕获或检测试剂，人體(tǐ)基质中的人體(tǐ)免疫球蛋白可(kě)导致显著的背景信号，可(kě)以选择使用(yòng)Isotype-specific anti-human antibody替代pan anti-human antibody，以减少干扰。
生物(wù)药和完全的人源抗體(tǐ)药都有(yǒu)可(kě)能(néng)产生ADA（也称為(wèi)抗药物(wù)抗體(tǐ)），会导致药物(wù)暴露量的损失、药效损失和严重的不良反应。免疫原性评估是临床研究中安全性评估的重要组成部分(fēn)，ADA通常采用(yòng)分(fēn)级方法进行检测（筛查）、确认和表征。ADA测定是半定量的，因為(wèi)这些测试方法缺乏标准曲線(xiàn)。阳性的定义是在测试切点以上的检测信号，由未接受药物(wù)的阴性样本的统计分(fēn)析确定。
针对抗體(tǐ)药ADA的测定也主要是通过LBA方法进行的。大多(duō)数ADA免疫分(fēn)析采用(yòng)桥接测试格式，即ADA桥接（bridge）/交联（crosslink）两个药物(wù)分(fēn)子结合。对抗體(tǐ)药中使用(yòng)较少的另一种方法是直接结合免疫测试（direct binding immunoassays），其中抗體(tǐ)药是捕获试剂，检测试剂则是检测ADA的Fc部分(fēn)。
在ADA检测中最常见的干扰是抗體(tǐ)药本身，样本中的药物(wù)与ADA结合，防止ADA与测试试剂形成复合物(wù)，在药物(wù)存在的情况下检测到ADA的能(néng)力，称為(wèi)药物(wù)耐药性。
在临床和非临床ADA试验方法验证过程中，监管机构会要求评估和排除这样的干扰，可(kě)以通过在药物(wù)浓度预期较低的时间点（drug wash-out phase）收集样本进行ADA测试来缓解药物(wù)干扰。在某些情况下，通过酸分(fēn)离可(kě)以提高药物(wù)耐受性。
（1）使用(yòng)酸解离药物(wù)-ADA复合物(wù)；
(2)在检测试剂的存在的情况下中和样本；
(3)进行测试
使用(yòng)高灵敏度的分(fēn)析方法和稀释样本是提高耐药性的有(yǒu)效方法，用(yòng)药物(wù)捕获ADA并通过Fc區(qū)域检测ADA的直接结合式LBA方法可(kě)能(néng)较少受到药物(wù)干扰，在这种方法中，只要ADA的一端可(kě)与药物(wù)捕获结合，就能(néng)检测到ADA。
桥接的测试格式则要求ADA的两端结合到测试试剂，Wu等人描述了一个直接结合式，以检测药物(wù)特异性的ADAs（IgE等型），并通过萃取抗體(tǐ)量总量，进而检测copurified 药物(wù)来定量ADA，这样可(kě)以完全消除药物(wù)干扰。Neubert等人通过protein G extraction，然后使用(yòng)LC-MS检测copurified药物(wù)，证明了此方法的可(kě)行性。表1 列举了一些用(yòng)于破坏ADA-药物(wù)复合物(wù)，以提高ADA检测灵敏度的方法（详见扩展阅读#2）。限于篇幅，本文(wén)不详细逐一讨论，请参阅本文(wén)末的参考文(wén)献。
样本基质中的药物(wù)靶标也可(kě)能(néng)干扰ADA检测，导致假阳性或阴性结果，桥接捕获和检测试剂的multimeric可(kě)溶性靶标能(néng)够产生假阳性结果。有(yǒu)报道称，在ADA测试中，含有(yǒu)CD20的细胞膜片段会对atumumab产生基质干扰，阴性结果可(kě)能(néng)是由于可(kě)溶性靶标与捕获和/或检测抗體(tǐ)结合，从而阻断中和性ADA的检测。下面的样本预处理(lǐ)，即用(yòng)阻断性抗體(tǐ)结合靶标，或用(yòng)结合蛋白对靶标进行阻断以及免疫消耗靶标，都可(kě)以消除这种干扰。例如，在针对ranibizumab的ADA方法开发过程中得到了证实。
虽然，大多(duō)数學(xué)者认為(wèi)未使用(yòng)生物(wù)药的个人不会有(yǒu)ADA，但有(yǒu)时在给药前就会检测到先前存在的抗體(tǐ)。值得一提的是，先前存在的抗體(tǐ)并不是干扰，且可(kě)能(néng)结合到抗體(tǐ)药物(wù)的任何地方。例如，检测到并确认了对panitumumab的中和性ADA，但报道说这些交叉反应性抗體(tǐ)并未改变药物(wù)PK或其安全性。
尽管如此，先前的ADA总是使得测试和结果解释变得更复杂。滴度和特异性测试有(yǒu)助于了解先前存在的抗體(tǐ)对给药后ADA发生率的贡献，针对cetuximab的先前存在的抗體(tǐ)有(yǒu)临床相关性，即先前存在的IgE抗體(tǐ)与严重的超敏反应有(yǒu)关。当一个抗體(tǐ)药物(wù)含有(yǒu)某个天然蛋白的免疫原性结构域而且大多(duō)数人以前可(kě)能(néng)接触到该结构域时，就很(hěn)可(kě)能(néng)会有(yǒu)预先存在的ADAs。在recombinant therapeutic immunotoxins，即anti-CD3-diptheria toxin 和anti-CD22 Pseudomonas exotoxin A的临床研究中，就观察到先前存在的ADA。
表1. 用(yòng)于破坏ADA-药物(wù)复合物(wù)，以提高ADA检测灵敏度的方法
在类风湿关节炎患者中较為(wèi)常见的类风湿因子(rheumatoid factor，RF)，它是针对IgG的Fc區(qū)域的抗體(tǐ)，主要為(wèi)IgM等型抗體(tǐ)。RF的结合亲和力低，预期不会在ADA测试中产生阳性信号，然而工程改造过的抗體(tǐ)药物(wù)可(kě)能(néng)对RF有(yǒu)更高的亲和力，从而可(kě)能(néng)在ADA检测中产生阳性信号。Araujo等人证明，在给药前的样本中，RF产生了阳性信号，而使用(yòng)抗人IgM抗體(tǐ)的样本预处理(lǐ)会减少RF的作用(yòng)。这种方法可(kě)能(néng)会影响IgM等型的ADA检测，作者筛查了含有(yǒu)和不含有(yǒu)抗IgM抗體(tǐ)的样本，并监测药物(wù)治疗期间滴度的增加。
可(kě)溶性蛋白生物(wù)标志(zhì)物(wù)、治疗性抗體(tǐ)和ADA的生物(wù)分(fēn)析是药物(wù)开发中不可(kě)分(fēn)割的一部分(fēn)，每一种分(fēn)析物(wù)都有(yǒu)其自身的挑战。避免基质干扰最有(yǒu)效的方法是对靶标生物(wù)學(xué)和待测物(wù)本身具有(yǒu)扎实的理(lǐ)论基础，并着重关注测试/分(fēn)析方法的特异性。
分(fēn)析技术也可(kě)能(néng)在防止或减轻测试干扰方面发挥重要作用(yòng)。在很(hěn)多(duō)情况下，稀释是减少干扰的有(yǒu)效工具，而最高的稀释倍数受到检测灵敏度的限制。高灵敏度的分(fēn)析平台在高稀释条件下，可(kě)以提供有(yǒu)效的工具，以尽量减少来自基质的干扰，分(fēn)离和纯化技术的改进可(kě)以有(yǒu)效地将待测物(wù)从干扰因子中分(fēn)离出来。例如，在ADA分(fēn)析中，有(yǒu)效地从抗體(tǐ)药物(wù)-ADA复合物(wù)中定量分(fēn)离出ADA就能(néng)解决其药物(wù)耐受性问题。
MS与LC结合已经成為(wèi)一种强大的定量方法，并且越来越多(duō)的应用(yòng)在蛋白药物(wù) (尤其是抗體(tǐ)药物(wù)偶联物(wù))和生物(wù)标志(zhì)物(wù)的生物(wù)分(fēn)析上。与LBA方法相比较，干扰对它的似乎不那么重要，因為(wèi)MS是特异性很(hěn)强的分(fēn)析方法。虽然分(fēn)析特异性在完全消除干扰方面会非常有(yǒu)帮助，但如果待测物(wù)在生物(wù)學(xué)上是完全等同的（identical），它也可(kě)能(néng)使生物(wù)分(fēn)析变得极其复杂。
在许多(duō)情况下，MS能(néng)够检测许多(duō)不同待测物(wù)的混合物(wù)，而LBA方法只能(néng)检测一种待测物(wù)。因此，LC-MS/MS在生物(wù)分(fēn)析中发挥越来越重要的作用(yòng)。本系列后续文(wén)章将介绍大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析中LC-MS/MS方法。敬请关注。
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