本期《袁来如此》為(wèi)系列文(wén)章《大分(fēn)子生物(wù)分(fēn)析概论》的第十三篇，旨在根据已发表的文(wén)献资料，对评估药物(wù)临床前PK/PD时，开发和选择LBA方法的策略作初步介绍。
由于内容篇幅较長(cháng)，本文(wén)将采取上下篇形式进行推送，敬请垂注！《袁来如此》专栏系广州博济医药微信公众号打造的科(kē)普學(xué)术专栏，内容均為(wèi)博济医药子公司深圳博瑞副总经理(lǐ)袁智博士原创。
1.导论
药物(wù)发现是一个快速的transformative的过程，其包括靶标识别、靶标验证、先导药物(wù)的识别和优化。随着项目推进经过这些阶段，对生物(wù)分(fēn)析的需求也在相应地改变。开发合适的生物(wù)分(fēn)析方法可(kě)以提供药代动力學(xué)和药效动力學(xué)（PK/PD）的宝贵数据，以支持在新(xīn)药研发项目不同阶段中关键的药效和安全性研究，从而為(wèi)项目的进展奠定坚实的基础。在新(xīn)药早期的发现阶段，会同时考虑不同药物(wù)模式（drug modalities）的多(duō)个分(fēn)子。一般有(yǒu)多(duō)种模式可(kě)供选择，取决于靶标及其位置，例如，传统的小(xiǎo)分(fēn)子、多(duō)肽、单克隆抗體(tǐ)、抗體(tǐ)-药物(wù)偶联物(wù)、纳米抗體(tǐ)、融合蛋白药物(wù)、双特异性生物(wù)药和寡核苷酸。在生物(wù)技术产业中，药物(wù)的快速发现以及快速开发正推动着生物(wù)分(fēn)析领域的发展和演进。这种演进的主要内容是，缩短分(fēn)析运行时间，实施multiplex分(fēn)析，提高灵敏度，降低样品體(tǐ)积的消耗，实现分(fēn)析测试的自动化。
本文(wén)关注的重点是临床前蛋白药物(wù)生物(wù)分(fēn)析方法的开发策略，即LBA分(fēn)析平台的选择和方法开发中的关键注意事项。本系列之前的文(wén)章，基本是关注用(yòng)于临床样本分(fēn)析的LBA方法。為(wèi)了简单起见，在此文(wén)中仅评估用(yòng)于检测蛋白药物(wù)的sandwich format的LBA，而蛋白药物(wù)在大多(duō)数情况下，意味着单克隆抗體(tǐ)。虽然相关技术有(yǒu)多(duō)方面的进步，本文(wén)将重点关注已经商(shāng)业化和在生物(wù)分(fēn)析行业十分(fēn)流行的技术。文(wén)末的参考可(kě)以引导读者非常详细地了解相关内容。
目前最流行的3种技术是ELISA、電(diàn)化學(xué)发光（ECL、MSD、NJ、USA）和Gyrolab®（Gyros Protein Technologies、Uppsala、Sweden）。 同时，本文(wén)会简要地涵盖以下几项不经常使用(yòng)但具有(yǒu)超高灵敏度的技术：如基于Single Molecule Array平台（单分(fēn)子阵列，Simoa™），单分(fēn)子计数[SMC™]的Erenna® 平台（Singulex Inc、CA、USA），免疫聚合酶链反应平台（immuno-polymerase chain reaction、immuno-PCR、 Imperacer®、Chimera Biotec GmbH、Dortmund、Germany）。另外，还会简要介绍multiplexing的Luminex平台（Luminex xMAPR、Luminex Corporation、TX、USA）。在药物(wù)发现阶段，分(fēn)析方法开发是生物(wù)分(fēn)析的主要内容之一，同时，应当特别考虑评估耐受性（tolerance）和分(fēn)子完整性（molecular integrity）。
2.临床前LBA方法的关键参数
用(yòng)于药物(wù)发现阶段的生物(wù)分(fēn)析方法有(yǒu)5个重要参数：样品體(tǐ)积要求，定量的动态范围，测试运行时间，灵敏度和自动化程度。本文(wén)将简要地评估这些参数，并介绍这些参数在选择检测平台时发挥的重要作用(yòng)。
1) 样本體(tǐ)积消耗
从小(xiǎo)鼠身上单次采集的血清或血浆样本的體(tǐ)积约為(wèi)50ml。随着在动物(wù)研究中尝试实施3R（替换replacement，减少reduction 和细化refinement ），生物(wù)分(fēn)析业界正在探索多(duō)种微體(tǐ)积采样方法，而这将进一步大幅度地减少样本體(tǐ)积。另外，在分(fēn)析小(xiǎo)鼠脑脊液等基质的样本时，只有(yǒu)2-5ml的體(tǐ)积可(kě)用(yòng)。考虑到有(yǒu)可(kě)能(néng)意外损失样本，故从动物(wù)获得的样本體(tǐ)积应足以分(fēn)析样本至少两次。因此，应当首选能(néng)够使用(yòng)低样本體(tǐ)积的分(fēn)析技术和平台。
2) 定量动态范围
能(néng)够在宽广的动态范围内，至少包含3-4个数量级，进行定量分(fēn)析是极其有(yǒu)益的。对于PK分(fēn)析，这允许较高的最小(xiǎo)稀释要求（minimum required dilution，MRD），以尽量减少样本基质效应，同时為(wèi)低剂量给药的样本提供所需的定量灵敏度。同样，对于PD，它允许在更宽广的范围内测试平行性（parallelism），从而允许对含有(yǒu)高浓度生物(wù)标志(zhì)物(wù)的样品进行大幅度的稀释。对于生物(wù)标志(zhì)物(wù)测量，稀释还有(yǒu)助于最大限度地减少样本和基于缓冲液的标准曲線(xiàn)（替代基质）之间的基质差异，从而更精确地生成定量数据。
3) 分(fēn)析运行时间
分(fēn)析运行时间是实施PK/PD样本分(fēn)析所需时间，假定使用(yòng)之前已為(wèi)该应用(yòng)开发分(fēn)析方法，这也意味着假定试剂已标记，缓冲液已制备，并且相关仪器也已准备就绪。在non-GLP临床前生物(wù)分(fēn)析实验室中，时间是至关重要的；在大多(duō)数情况下，最终目标是提供可(kě)靠，且可(kě)以重现的数据，同时保持较短的分(fēn)析运行时间。这就提高了实验室的效率，并允许该部门同时支持多(duō)个项目。分(fēn)析96样本微孔板的运行时间可(kě)以在1-5小(xiǎo)时的范围之间，具體(tǐ)取决于采用(yòng)的分(fēn)析技术（对于某些分(fēn)析技术，有(yǒu)额外的隔夜捕获步骤overnight capture step）。
4) 灵敏度
大多(duō)数传统的单克隆抗體(tǐ)的PK定量LLOQ在几个ng/ml范围。一些高效力药物(wù)分(fēn)子（需要低剂量）和低丰度（或下调了的）的生物(wù)标志(zhì)物(wù)可(kě)能(néng)需要更高的灵敏度。应当依据个案的情况為(wèi)这些应用(yòng)选择相应的分(fēn)析平台。此外，高灵敏度的分(fēn)析方法是高度依赖所使用(yòng)的试剂，因此获得高特异性和高亲和力的试剂可(kě)以大大提高定量的灵敏度。提升分(fēn)析灵敏度也同时降低了对样本體(tǐ)积的要求，见1）。
5) 自动化
自动化平台可(kě)缩短分(fēn)析人员操作的时间，提高生物(wù)分(fēn)析部门的效率。在临床前药物(wù)开发的环境中，分(fēn)析平台的完全自动化，在需要开发分(fēn)析方法且进行常规样本分(fēn)析的情况下是非常有(yǒu)益的。同时，对于方法开发，优化和因基质或物(wù)种变化而进行的方法认证，需要能(néng)够修改自动化平台上的检测方法的灵活性。
除了分(fēn)析测试自动化之外，还可(kě)以自动化地制备标准品（standards）和质量控制样品（QCs），从而节省时间，降低珍贵参照（比）物(wù)料（reference material）的使用(yòng)和成本，并减少手动移液产生的误差。一些分(fēn)析测试平台，如Gyrolab，允许检测的全自动化，而Hamilton和HPD300这样的平台，则可(kě)以允许自动化移液體(tǐ)，或制备标准品和QCs。超高灵敏度的Simoa™平台也支持自动化地样本检测。
3.临床前LBA免疫测试平台
目前，有(yǒu)多(duō)种LBA测试平台在新(xīn)药开发中得到应用(yòng)。表1列出了若干LBA测试平台及其比较。本文(wén)将进一步介绍其中几种在生物(wù)分(fēn)析行业中应用(yòng)比较广泛的平台。由于為(wèi)临床前研究开发分(fēn)析方法所选择的LBA平台，很(hěn)可(kě)能(néng)会继续在临床研究中继续使用(yòng)，因此，选择合适的测试平台，将会是影响深遠(yuǎn)的一个重大决定。
表1. 若干LBA测试平台相关特征的比较
备注：上表中的方法未全部在文(wén)中详细介绍。
近年来，一系列immunoassay的新(xīn)技术，特别是基于微（磁）珠（beads，magnetic，etc.）的技术，从测试格式的物(wù)理(lǐ)學(xué)/物(wù)理(lǐ)化學(xué)层次，待测物(wù)的捕获，检测信号的收集/放大，数据处理(lǐ)等方面，实现了显著改善，并取得了相当的商(shāng)业性成功，虽然这些新(xīn)方法在化學(xué)和生物(wù)學(xué)层次，仍然是基于抗體(tǐ)-抗原的结合作用(yòng)以及基本的夹心式immunoassay。本文(wén)选择若干得到广泛商(shāng)业应用(yòng)的测试平台，及其在临床前生物(wù)分(fēn)析方法开发的应用(yòng)作初步介绍，希望起到抛砖引玉的目的，引发更多(duō)关于新(xīn)的分(fēn)析测试技术的开发和应用(yòng)的相关讨论、交流和研究。
ELISA平台
ELISA是生物(wù)制药行业内外使用(yòng)最广泛的配體(tǐ)结合式（LBA）检测平台。ELISA的测试格式包括直接式、间接式和夹心式；ELISA经常用(yòng)作与开发中的新(xīn)分(fēn)析平台进行比较的基础；在96孔板上，通常对样本进行复孔（duplicate）测定，手动或半自动运行。通常使用(yòng)比色法的检测试剂，但有(yǒu)时也使用(yòng)其他(tā)检测试剂，如发光（luminescence）和荧光（fluorescence）。通常，对ELISA方法，需要监测试剂，如抗體(tǐ)（antibodies）、配體(tǐ)（ligands）、缓冲液（buffers）以及批次的变化。
几十年来，传统的ELISA一直是蛋白质定量分(fēn)析最常用(yòng)的技术，因此也是最可(kě)靠的技术之一。即使在今天，大多(duō)数生物(wù)标志(zhì)物(wù)的商(shāng)业检测试剂盒都是基于ELISA的。多(duō)数新(xīn)分(fēn)析技术都与作為(wèi)金标准的ELISA比较。但是，这种分(fēn)析技术也有(yǒu)缺点，例如，测试运行时间约長(cháng)為(wèi) 4-5 小(xiǎo)时，样品體(tǐ)积消耗大（测定體(tǐ)积為(wèi)100 ml），灵敏度低与LLOQ在大多(duō)数情况下接近低-中ng/ml，以及狭窄定量动态范围（2-3 数量级）。这项技术对于某些临床前生物(wù)分(fēn)析的应用(yòng)仍然很(hěn)有(yǒu)吸引力，比如血清单克隆抗體(tǐ)的PK。该平台还提供了在方法开发早期阶段评估测试方法不同部分(fēn)的灵活性。表2列出了不同检测平台的性能(néng)，以一个mAb药物(wù)為(wèi)例。
表2. 与ELISA比色法检测相比较，一个mAb在若干检测平台上LBA方法参数的比较
备注：上表中的方法未全部在文(wén)中详细介绍。
電(diàn)化學(xué)发光(Electrochemiluminescence，MSD)平台
MSD平台是一种基于微孔板的测试格式，它利用(yòng)電(diàn)化學(xué)发光（ECL）信号进行检测。在这个平台上，免疫测试格式类似于用(yòng)于药物(wù)定量和target sample measurements的典型ELISA格式，但预计灵敏度会因使用(yòng)化學(xué)发光而增加。MSD平台似乎主要在检测信号的产生和收集上，相对于ELISA有(yǒu)显著改善：MSD采用(yòng)SULFO-TAG（三联吡啶钌）是一种发光底物(wù)，其分(fēn)子量约為(wèi)1000Da（大约是HRP的1/40），因此空间位阻小(xiǎo)，易于标记抗體(tǐ)，且不易妨碍其与待测物(wù)或其它抗體(tǐ)的结合。SULFO-TAG在阳极表面失去電(diàn)子，发生氧化，在三丙胺阳离子自由基的催化及三角形脉冲電(diàn)压激发下，可(kě)产生高效、稳定、连续的電(diàn)化學(xué)发光信号，使得检测信号增强并稳定（见图1）。
图1. MSD的電(diàn)化學(xué)发光产生的检测信号
MSD的電(diàn)化學(xué)发光技术在生物(wù)分(fēn)析行业广受欢迎。它保持了ELISA格式的优点，如方法开发的灵活性，另外在其它领域也非常出色，如较小(xiǎo)的样品體(tǐ)积要求（测定體(tǐ)积為(wèi)25–30 ml），更高的灵敏度（低-中pg/ml）和宽泛的动态范围（4-5个数量级）。当以均相的测试格式运行时，此平台可(kě)能(néng)受到钩效应（hook effect）的影响。钩效应起源于不合适的抗體(tǐ)-抗原浓度比例，但是可(kě)以减轻甚至消除的。此外，试剂和微孔板容易有(yǒu)批次间的变化，因此，强烈建议在批次之间进行交叉比较。
MSD微孔板的孔底為(wèi)石墨底，捕获抗體(tǐ)包被载量可(kě)提升10-50倍，检测范围比ELISA扩展了10-100倍，定量动态范围高达5-6个数量级，灵敏度可(kě)提升10-1000倍（fg/ml-pg/ml级别）。根据对血清免疫學(xué)中的“带现象”的理(lǐ)解，可(kě)推测：包被抗體(tǐ)载量可(kě)以根据检测灵敏度的需要进行调整，以避免钩效应（hook effect）。分(fēn)析运行时间接近约3-4小(xiǎo)时，但考虑到该平台提供的其它优势，测试时间可(kě)被视為(wèi)一个合理(lǐ)的折中。该平台允许同时运行多(duō)个96孔板，因此在分(fēn)析数百个样品时，测试一个或多(duō)个96孔板也只需要基本相同的时间，这一点可(kě)能(néng)非常有(yǒu)利。此平台不是自动化的，因為(wèi)它需要分(fēn)析人员参与每个步骤。此外，该平台还提供与实验室信息管理(lǐ)系统（LIMS）的集成和US FDA 21 CFR part 11的合规性，允许分(fēn)析方法结果容易地转移到GLP的环境中。
Gyrolab平台
Gyrolab是一个非96微孔板的免疫测试平台，具有(yǒu)液體(tǐ)处理(lǐ)功能(néng)（liquid handling capability），使用(yòng)小(xiǎo)體(tǐ)积的样本和试剂在光盘（CD）上实施免疫测定。该测试格式使用(yòng)biotinylated捕获试剂和标记有(yǒu)fluorophore的检测试剂，在纳升體(tǐ)积的使用(yòng)亲和力微珠填料的捕获柱（nanoliter volume affinity capture column）上进行测试。利用(yòng)CD的微观结构确定样品和试剂的體(tǐ)积，并通过旋转CD将样本加到捕获柱上。在每个CD上，有(yǒu)96（在1000nlCD上）-112（在20或200nl CD上）个微观结构，可(kě)产生96-112个数据点（1小(xiǎo)时/CD运行时间）。在Gyrolab工作站上，样品处理(lǐ)完全自动化，液體(tǐ)处理(lǐ)臂将样品和试剂从微孔板转移到CD，并通过激光/检测器测定每个捕获柱的荧光信号。基础的Gyrolab xPlore™ 允许无人值守地一次分(fēn)析1张CD，而Gyrolab xPand™允许分(fēn)析多(duō)达5张CD（即480-560个数据点）。在大多(duō)数情况下，动态范围為(wèi)3-4个数量级。该平台的灵敏度可(kě)与MSD的ECL平台（低-中pg/ml）相媲美。
Gyrolab是一个自动化的微流體(tǐ)系统（microfluidic system），且其离心操作能(néng)够高效地处理(lǐ)微量體(tǐ)积，因此大多(duō)数重复(duplicate）分(fēn)析只需要小(xiǎo)于5ml的样本體(tǐ)积，就可(kě)以从同一微孔板重新(xīn)分(fēn)析未使用(yòng)的样品。该平台使用(yòng)包被了捕获抗體(tǐ)的微珠来捕获待测物(wù)，与下面讨论的Luminex和Simoa平台在捕获待测物(wù)的原理(lǐ)上，即在更大的固相表面积上有(yǒu)更多(duō)的捕获抗體(tǐ)（与ELISA相比），似乎有(yǒu)异曲同工之妙，总體(tǐ)效果是提升了捕获待测物(wù)的效率，提升了灵敏度。Gyrolab的一个出色特点是，可(kě)以选择不同的CD来调整定量的动态范围，以满足对低或高浓度样本的分(fēn)析。该分(fēn)析技术平台对于大分(fēn)子的常规临床前PK/PD分(fēn)析无疑是非常有(yǒu)效的。此平台在缩短检测时间方面非常有(yǒu)效，无需人工移液和参与分(fēn)析的每一步骤。这使得该平台对开发方法和分(fēn)析样本都极具吸引力。此外，该平台还提供实验室信息管理(lǐ)系统集成和FDA 21 CFR part 11合规性，能(néng)够将分(fēn)析方法轻松地转移到GLP环境中去。
Gyros的一个可(kě)能(néng)缺点是，如果以基于微孔板格式开发了分(fēn)析方法检测，则相同的试剂在转移到Gyros时可(kě)能(néng)会性能(néng)欠佳，并且可(kě)能(néng)需要显著地优化才能(néng)获得最佳性能(néng)。这是因為(wèi)Gyros的孵育时间极短，需要高结合效率的捕获试剂，而基于微孔板的检测则不需要这种试剂，因為(wèi)较長(cháng)的孵育时间抵消了该需求。因此，如果使用(yòng)Gyros，则需要在同一平台对试剂进行筛选，然后测试其分(fēn)析性能(néng)，并开发完整的分(fēn)析方法。
BIAcore平台
基于BIAcore平台的药物(wù)分(fēn)析，依赖于待测物(wù)与固定在传感器芯片（sensor chip surface）表面的待测物(wù)特异的试剂的相互作用(yòng)。BIAcore实时监测该结合相互作用(yòng)，并读出以相对响应单元（relative response units，RU）為(wèi)单位的响应，该响应与Surface Plasmon Resonance（SPR）角度的变化相关，并且由传感器芯片表面的液體(tǐ)薄膜的折射率变化所决定。折射率的变化与芯片表面结合的质量成正比。这种实时的无标记技术与典型的免疫测定法有(yǒu)很(hěn)大的不同，免疫测定法需要多(duō)个孵育和洗涤步骤，以及用(yòng)于信号读出的标记检测抗體(tǐ)（labeled detection antibody）。对于临床前药物(wù)分(fēn)析，可(kě)以将抗药物(wù)特异性抗體(tǐ)固定在芯片表面实施通用(yòng)化检测，当样本流经分(fēn)析隔室（cell）时，该抗體(tǐ)将结合样本中所含有(yǒu)的mAb药物(wù)。其它方式，如在芯片上固定待测物(wù)，也可(kě)用(yòng)于特定的定量分(fēn)析。对于此平台，在验证期间必须经过10个周期的残留（carry-over）测试，并且还应确定最大信号值（相对于背景值）的信号噪声比（signal-to-noise ratio），以评估样本分(fēn)析期间的方法运行性能(néng)。此外，还必须评估在执行大批量样本分(fēn)析的较長(cháng)时期内的芯片稳定性（分(fēn)析方法是特定于所使用(yòng)的芯片类型）。由于该平台通常运行一夜或更長(cháng)时间，故样本和试剂的稳定性必须比典型的免疫测试方法具有(yǒu)更長(cháng)的短期稳定性（超过24小(xiǎo)时），而且在Biacore T200上，样本的总通量（overall sample throughput）较低。此外，单个分(fēn)析运行需要包含校准曲線(xiàn)后和运行序列中间隔的QC样本。通常，这对应于一个微孔板的校准品（calibration standards，Cs）和样本。
可(kě)以对BIAcore实施IQ/OQ/PQ验证，以满足符合21 CFR Part 11的要求。使BIAcore仪器达到GLP合规的状态不是一个简单的过程，需要投入大量时间来处理(lǐ)数据传输（data transfer）和合适的校准（随时间推移的）等问题。
该测试平台更多(duō)地用(yòng)于LBA关键试剂的筛选和表征。LBA关键试剂一般定义為(wèi)：对待测物(wù)（analyte）特异性的LBA分(fēn)析试剂，如抗體(tǐ)、多(duō)肽、蛋白质、耦合物(wù)（标记），作為(wèi)试剂的药物(wù)和ADA试剂（阳性和阴性对照品）。
多(duō)通道（multiplexing）分(fēn)析技术
Multiplexing测试方法可(kě)以节省时间和宝贵的样品。但是，存在一个局限：即它们经过严格优化，只能(néng)在指定范围和基质中使用(yòng)。不同的待测物(wù)对不同的基质和稀释的反应不同，因此，对于某个待测物(wù)，优化参数的偏差可(kě)能(néng)需要重新(xīn)优化整个multiplexing检测方法。在临床前生物(wù)分(fēn)析中，需要探索了解多(duō)种药物(wù)、多(duō)个药物(wù)变异體(tǐ)、多(duō)种药物(wù)的组合和多(duō)种生物(wù)标志(zhì)物(wù)。因此，检测的灵活性是非常关键的，对此multiplexing可(kě)能(néng)帮助意义不是很(hěn)大。
在样本體(tǐ)积十分(fēn)有(yǒu)限的特殊情况下，可(kě)以探索multiplexing。允许自主开发multiplexing方法的平台包括：Luminex的xMAP技术，使用(yòng)独特的dyed beads，并取决于所使用(yòng)的仪器（MAGPIX、LUMINEX 200或FLEXMAP 3D），可(kě)以分(fēn)析50-500待测物(wù)；Quanterix SR-X，使用(yòng)6个独特的磁珠，可(kě)以multiplexing多(duō)达6个待测物(wù)；Quanterix SP-X可(kě)以multiplexing到10个待测物(wù)，使用(yòng)其基于平面阵列的空间分(fēn)离的化學(xué)发光成像技术。其中，MSD允许从黄金标准的singleplex平台直接转换到U-PLEX平台进行检测；Quanterix的SR-X和SP-X平台在multiplexing时能(néng)够提供超高灵敏度。
Luminex平台
常用(yòng)的Luminex®100/200™系统是基于流式细胞學(xué)（flow cytometry）原理(lǐ)的灵活程度很(hěn)高的分(fēn)析仪。该系统使用(yòng)很(hěn)小(xiǎo)的样本體(tǐ)积，在单个微孔板的孔/井中multiplex（同时测定）多(duō)达100个待测物(wù)。该平台可(kě)以操作许多(duō)检测格式，包括核酸测试方法（nucleic acid assays）、受體(tǐ)-配體(tǐ)测试方法（receptor-ligand assays）、免疫测试方法（immunoassays）和酶测试方法（enzymatic assays），并提供快速且经济高效的生物(wù)测试结果。
该系统是xMAP® 3个核心检测技术的组合。第1个是xMAP微球，这是一个荧光染色，微米大小(xiǎo)的聚苯乙烯微球系列，既作為(wèi)标识符，又(yòu)充当建立测试方法的固體(tǐ)表面。第2个是基于流式细胞學(xué)的仪器（flow cytometry-based instrument），Luminex 100/200分(fēn)析仪集成了关键的xMAP检测组件，如激光、光學(xué)器件、流體(tǐ)技术和高速数字信号处理(lǐ)器。第3个组件是xPONENT®软件，它专门设计為(wèi)基于方案（protocol-based）的数据采集方式，具有(yǒu)强大的数据回归分(fēn)析的能(néng)力。
Luminex利用(yòng)特定染料的珠子（beads），该珠子包被有(yǒu)特定的抗待测物(wù)抗體(tǐ)。添加待测物(wù)孵育后，再添加荧光标记的抗體(tǐ)，以检测和定量待测物(wù)。此项技术使用(yòng)供应商(shāng)预先生产的试剂盒，主要用(yòng)于PD检测，即生物(wù)标志(zhì)物(wù)的定量分(fēn)析，并且采用(yòng)多(duō)通路检测（multiplexing）的方式。商(shāng)业化的试剂盒数量巨大，据称达1,300余种。一个样本可(kě)以用(yòng)于测定多(duō)个待测物(wù)，据称最多(duō)可(kě)达500个，并且可(kě)以对每种待测物(wù)设置接受标准。不足之处是：不同待测物(wù)珠子（analyte beads）有(yǒu)交互干扰（cross-talk）的倾向，而且测试方法对光敏感，因此必须采取特殊的预防措施。
超高灵敏的定量分(fēn)析技术
对于某些药物(wù)和样本基质，可(kě)能(néng)需要具有(yǒu)fg/ml-低pg/ml的超高灵敏度的定量分(fēn)析方法。相关状况包括定量低丰度的生物(wù)标志(zhì)物(wù)，对强效药物(wù)分(fēn)子的PK分(fēn)析和定量极易受到基质效应影响的待测物(wù)，显然，大幅度稀释样本会提升对测定平台灵敏度和定量动态范围的要求。
目前，允许自主开发方法的超高灵敏度的定量分(fēn)析平台包括来自Quanterix，基于Simoa™的数字化ELISA，来自Singulex的使用(yòng)单分(fēn)子计数（single molecule counting）的Erenna™，以及来自Chimera Biotec GmbH的基于免疫PCR（immuno-PCR）的Imperacer。
之前已经发表的文(wén)章详细评估了这3种超高灵敏度的分(fēn)析技术，以及其它不太流行的分(fēn)析技术。这3种技术都是需要供应商(shāng)提供检测方法的分(fēn)析仪器，但都允许用(yòng)户自主开发检测方法。当拥有(yǒu)实时定量PCR（qPCR）仪器（thermal cycler fitted with a fluorimeter）时，还可(kě)以独立于供应商(shāng)提供的试剂或仪器开发Immuno-PCR方法。在使用(yòng)这些技术时，需要特别注意一些非常规情况，包括Simoa™ 的磁珠偶合，DNA与检测试剂的偶合，以及无污染地操作immuno-PCR。
基于单分(fēn)子阵列（Simoa™）的数字化ELISA
来自Quanterix公司的Simoa™数字化ELISA是一个很(hěn)有(yǒu)前途的平台，它可(kě)以使蛋白质定量达到fg/ml。该技术采用(yòng)基于微观顺磁珠（microscopic paramagnetic bead）的免疫测试方法，并结合独特的信号检测和数据采集系统。数字化ELISA分(fēn)2个阶段实施。在捕获抗原的第1阶段，涂有(yǒu)捕获试剂的微观磁珠与样品混合，然后加入生物(wù)素标记的检测抗體(tǐ)（biotinlabeled detection antibody）和链球菌素-β-半乳糖酶（streptavidin–b-galactosidase）。然后，这些珠子被加载到光盘上，光盘上装有(yǒu)一系列體(tǐ)积為(wèi)飞升（femtoliter）大小(xiǎo)的微井阵列。每个微井的直径為(wèi)4.5mm，能(néng)够容纳直径為(wèi)2.7mm的珠子数目只能(néng)為(wèi)1或者為(wèi)0。被硅胶垫片密封的微井含有(yǒu)荧光底物(wù)，其用(yòng)于信号生成和放大（图2）。Simoa™ 技术在定量分(fēn)析的第二阶段采用(yòng)了独特的信号检测系统。微井（50飞升）中浓度相对较高的发出荧光的产物(wù)（阳性事件）和白光散射（white light scattering）测定的总珠子负载可(kě)以由标准的CCD摄像机轻松地检测到和记录。通过改进几个检测步骤，Simoa™ 实现了超高灵敏度。
图2. 在飞升體(tǐ)积（femtoliter）的井阵列中装载，密封和成像单个顺磁珠
因為(wèi)在100mL的反应體(tǐ)积中有(yǒu)约200,000个磁珠，而每个磁珠捕获约80,000个抗體(tǐ)分(fēn)子，抗體(tǐ)-待测蛋白的比值和平衡允许高效地在给定的示例中，>70%捕获待测物(wù)。由于溶液中有(yǒu)这么多(duō)的磁珠，而且可(kě)以在溶液中运动，所以捕获效率进一步提高，因為(wèi)每个目标蛋白在不到1分(fēn)钟时间内就会遇到磁珠。这与传统的LBA方法中，固定在一个表面的捕获抗體(tǐ)与待测物(wù)的缓慢结合完全相反。另外，优化了的biotin-labeled detection antibody与streptavidin–b-galactosidase之间的比值，可(kě)减少检测背景并最大化特定信号的采集。与Simoa™检测系统相结合，相关荧光信号可(kě)以通过荧光底物(wù)（fluorogenic substrate）的酶消化（enzymatic digestion），而进一步放大。
Simoa™ 检测系统能(néng)够检测到单个结合事件（a single binding event），该事件可(kě)以在低浓度下以数字方式获得（灵敏度增高，数字化ELISA），或在高浓度模式下以模拟的方式获得（扩展了的定量动态范围）。荧光用(yòng)于检测酶活性，并能(néng)够测定每个磁珠上酶的平均值。与下面描述的Erenna®平台一样，结合数字式和模拟式的读数功能(néng)，可(kě)以实现非常宽广的定量动态范围。由于最终信号采集是在平面阵列上完成标准成像，因此与使用(yòng) Erenna®等流體(tǐ)系统的数值读出相比，数据采集更快。
尽管Erenna® 和Simoa™ 平台具有(yǒu)数字读出和宽广的定量动态范围等共同点，但Simoa™ 平台是一个完全自动化的系统，该仪器可(kě)以实施样品稀释（高达1:10稀释），混合，洗涤，孵化和数据采集步骤。Simoa™ 能(néng)够同时测定多(duō)达10种不同的待测物(wù)（multiplexing）。这是通过对单个捕获抗體(tǐ)使用(yòng)不同的dye linkers来实现的。之后，对阵列进行多(duō)个波長(cháng)的荧光成像，以识别拥有(yǒu)不同dye linkers的亚组，并确定是否存在enzyme reporter标记。与Singulex和Quanterix一样，有(yǒu)许多(duō)试剂盒可(kě)供选择。也可(kě)以“定制”开发，或“自主开发”分(fēn)析方法。
凭借较高的灵敏度、multiplexing和自动化功能(néng)，该平台看起来非常理(lǐ)想。Simoa™平台与LIMS系统兼容，其软件满足监管级别的生物(wù)分(fēn)析据FDA 21 CFR part 11的合规性要求。筆(bǐ)者认為(wèi)该平台因其超高灵敏度（可(kě)以使用(yòng)微量样本體(tǐ)积）和自动化操作，在相当的程度上可(kě)以替代Gyrolab平台，用(yòng)于临床前PK样本分(fēn)析。
Singulex Erenna®平台
Erenna®免疫测试系统利用(yòng)两步的过程实现超高灵敏度定量分(fēn)析（ultrasensitive assays）。最初，使用(yòng)biotinylated capture试剂和荧光标记检测试剂，在96孔板中实施基于珠子（beads）的夹心式测试格式。从珠子上洗脱的被捕获待测物(wù)被转移到一个384孔的读取板（reading plate），然后将该读取板放置到检测仪器上。然后样本一个接一个地通过毛细管进入flow cell，并在其中实施激光诱导的单分(fēn)子检测分(fēn)析。该平台的优势是宽广的定量动态范围，其通过独特的软件曲線(xiàn)拟合算法实现。该算法利用(yòng)了多(duō)次读数，提升了灵敏度。
与其它测试平台相比，检测时间较長(cháng)，但一些線(xiàn)下的自动化设备可(kě)用(yòng)于洗涤和转移步骤。该平台通常用(yòng)于PD检测，但也可(kě)用(yòng)于PK定量分(fēn)析。对供应商(shāng)生产和供应的试剂盒，其稳定性必须由最终用(yòng)户评估，因為(wèi)试剂的稳定性通常是未知的。此外，可(kě)以購(gòu)买通用(yòng)试剂，以开发内部的检测试剂，而且，基于微孔板的格式也能(néng)兼容使用(yòng)96或384孔板的平台。供应商(shāng)建议对校准品（Cs）进行3次复测（triplicate），以便在低浓度下进行精确分(fēn)析。可(kě)以通过IQ/OQ程序，与内部PQ相结合，验证Erenna®平台。如果将Erenna®与LIMS结合，以实施监管级生物(wù)分(fēn)析，则一个选择是使用(yòng)读出的三个信号之一进行浓度分(fēn)析。但是，动态范围和灵敏度可(kě)能(néng)会受到影响，具體(tǐ)取决于选择哪个读出的信号。
Immuno-PCR (Polymerase Chain Reaction)
Immuno-PCR（Chimera）是一种扩增免疫测试技术（signal amplification immunoassay）。它涉及DNA标记的检测抗體(tǐ)的扩增，从而提高灵敏度。与ELISA中使用(yòng)的抗體(tǐ)-酶偶合物(wù)（antibody–enzyme conjugates）不同，IPCR中的关键试剂是抗體(tǐ)-DNA偶合物(wù)（antibody–DNA conjugates），其中一个DNA标记（marker）与检测抗體(tǐ)相偶合。然后，将DNA polymerase加入到反应主混合物(wù)之中，就可(kě)以放大检测信号，并通过定量PCR（qPCR）而定量测定DNA-marker的浓度，从而定量分(fēn)析analyte–antibody immunocomplex。因此，该技术主要改进了检测信号的放大方法。但是，如果检测抗體(tǐ)与血清或血浆中的成分(fēn)发生交叉反应，该平台可(kě)能(néng)容易受到强大基质效应的影响。因此，在方法验证期间必须评估信噪比，并用(yòng)于确定样本分(fēn)析期间方法的性能(néng)。
该平台的优点包括宽广的定量动态范围和提升了的灵敏度，这对PD分(fēn)析是很(hěn)有(yǒu)益的。与 Erenna®平台一样，检测试剂高度依赖于供应商(shāng)，对于大批量样本分(fēn)析来说，成本可(kě)能(néng)很(hěn)高。如同MSD、Erenna®和其它基于珠子的平台一样，应特别注意标记试剂和微孔板批次的变化。由于该平台依赖于PCR技术，因此在处理(lǐ)样本、试剂和移液器枪头时必须小(xiǎo)心谨慎，以避免污染。此外，数据分(fēn)析可(kě)能(néng)也会较為(wèi)麻烦（cumbersome）。
7. 特别声明
本文(wén)如有(yǒu)疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有(yǒu)引用(yòng)的原始信息和资料均来自已经发表學(xué)术期刊, 官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。 参考文(wén)献的选择考虑到多(duō)样化但也不可(kě)能(néng)完备。欢迎读者提供有(yǒu)价值的文(wén)献及其评估。
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