限于篇幅，本文(wén)只探讨3个议题，对其它相关问题感兴趣的读者请阅文(wén)末的参考文(wén)献。
将ELISA方法转移到其它分(fēn)析平台
在开发临床前LBA分(fēn)析方法时，ELISA可(kě)能(néng)是首选的方法，因其简单性，低成本，并且不需要专门的仪器设备。但是，如果ELISA方法不能(néng)满足灵敏度和稳健性要求时，特别是对GLP毒理(lǐ)/毒代研究而言，需要在一个CRO实施该研究时，往往需要将一个ELISA方法转移到MSD或者GYROS平台至上实施。
MSD
从ELISA转移到MSD平台相对简单；当使用(yòng)特定抗體(tǐ)对的ELISA方法无法到达所需要的灵敏度时，会经常实施这样的转移来减少基质效应，提高灵敏度或增加定量动态范围。然而，就像其它方法转移一样，试剂的差异和不同的修饰（modifications），如ruthenium或生物(wù)素标记，可(kě)能(néng)会影响方法的效能(néng)。因此，虽然可(kě)以在MSD上重新(xīn)使用(yòng)已有(yǒu)的抗體(tǐ)对和测试格式，但将需要调整校准品（Cs）和QCs的浓度，并充分(fēn)验证新(xīn)的方法。
Gyrolab
在理(lǐ)想的情况下，需要小(xiǎo)體(tǐ)积样本或半自动化的分(fēn)析方法应当直接在Gyrolab平台上开发。如果一对抗體(tǐ)（antibody pair）可(kě)用(yòng)于相同的捕获-检测组合，则将ELISA方法直接成功地转移到Gyrolab上的可(kě)能(néng)性更大； 尽管可(kě)能(néng)需要重新(xīn)优化，以提高灵敏度和/或扩展动态范围。 重新(xīn)优化包括测试抗體(tǐ)对的组合；调整抗體(tǐ)浓度，以最大化灵敏度和动态范围；测试选择性，以尽量减少MRD；以及重建动态范围和QC水平。在转移方法到Gyrolab平台的时候，修改试剂，如使用(yòng)生物(wù)素（biotin）或荧光标记，也会影响测定性能(néng)。在任何情况下，都需要在此平台实施完全的方法验证。
BIAcore
BIAcore和ELISA之间的差异太大，不能(néng)直接转移分(fēn)析方法；因此，需要进行方法的再开发，和全面的方法验证。 由于BIAcore是一个基于流體(tǐ)的系统，因此不宜直接与基于固相（例如，微孔板）的免疫测试方法进行比较。需要进一步开发BIAcore方法，例如芯片的固定（immobilization）和再生条件，用(yòng)于固定和再生缓冲液的试剂，试剂的稳定性，确定标准品和质量控制样品，以及配體(tǐ)结合测试（LBA）方法的其他(tā)方面。
Luminex
如果以Luminex格式定量单个待测物(wù)，则从ELISA格式的方法转移在测试方法的布局方面非常简单，尽管需要制备，评估和验证新(xīn)的试剂（例如，dye-coated beads，荧光标记的检测抗體(tǐ)）。有(yǒu)时，在洗涤步骤中需要额外的微孔板（真空或磁珠板）。如果需要将多(duō)个ELISA方法组合并转移到一个Luminex方法（由于其multiplexing功能(néng)），则需要进行额外的研究；并且，优化方法参数可(kě)能(néng)需要更多(duō)的方法开发时间。总體(tǐ)而言，必须全面验证单通路和multiplex格式的Luminex方法；ELISA方法中使用(yòng)的条件有(yǒu)助于确定开发Luminex方法的格式和抗體(tǐ)对。
分(fēn)析大数量样本和仪器故障
MSD
对于在MSD上的样本分(fēn)析，校准品（Cs）和QCs的位置通常与ELISA的位置相同。另一方面，值得注意的是：对微孔板一次只读取四个孔的数据，而且在施加電(diàn)压后只能(néng)读取一次。因此，如果发生仪器故障，可(kě)能(néng)无法测定整个校准曲線(xiàn)；或者取决于微孔板设置（plate set-up），可(kě)能(néng)缺少一组QC的一部分(fēn)，这通常发生在水平设置（horizontal set-up）中。对于垂直设置（vertical set-up），更有(yǒu)可(kě)能(néng)获得校准品和第1组QC，而不是第二组QC。在这两种情况下，将需要重新(xīn)读取整个微孔板。如果仪器发生故障，而且读数缓冲液已添加到微孔板中，则可(kě)能(néng)需要重新(xīn)分(fēn)析（re-assay）样品，因為(wèi)检测信号会随时间显著地减少。
Gyrolab
通常，一个分(fēn)析运行被定义為(wèi)一个CD，在每个CD上都放置有(yǒu)校准品和 QCs。如果放置在不同CDs上的QCs的精密度和偏差符合接受标准，则在无人值守的运行中处理(lǐ)的最多(duō)五张CDs的系列可(kě)以定义為(wèi)一个单次运行。 这需要测试和评估一个给定的格式是否满足上述接受标准，因為(wèi)这取决于能(néng)否快速捕获待测物(wù)的和试剂的稳定性。
需要将接受标准应用(yòng)于每个CD，这意味着具有(yǒu)失败的QCs和/或失败校准曲線(xiàn)的CDs会被拒绝，而来自同一个多(duō)个CD运行中的其它CDs可(kě)以通过。如果含多(duō)个CD的运行仅有(yǒu)一条标准曲線(xiàn)，并且此曲線(xiàn)不符合接受条件，则此多(duō)个CD的运行的所有(yǒu)数据将被拒绝。由于多(duō)个CD运行的风险，故应在方法验证时，需要对样品分(fēn)析时的校准曲線(xiàn)和QCs设置进行评估。在任何情况下，每个CD都必须含有(yǒu)QCs。
如果在运行过程中怀疑针头故障，例如，观察到结构之间（inter-structure）高的CVs，则需要使用(yòng)供应商(shāng)提供的仪器日常维护测试方法，测试液體(tǐ)处理(lǐ)装置的性能(néng)。故可(kě)以识别不符合接受标准的样本，校准品或QCs所使用(yòng)的针头，并可(kě)以在未来的运行中重新(xīn)分(fēn)析。液體(tǐ)处理(lǐ)装置有(yǒu)10个针头，分(fēn)析数据指明了用(yòng)于转移某一样本的针头。
一些较新(xīn)的LBA分(fēn)析平台，包括Gyrolab，提供比ELISA更宽泛的动态范围。尽管如此，仍建议使用(yòng)相同数量的校准品和 QCs（在每个CD/微孔板的每个QC级别重复两次）进行验证（LLOQ，LQC，MQC，HQC，ULOQ）和样品分(fēn)析（LQC，MQC，HQC），如同对ELISA方法建议的那样。
Luminex
常见的做法是设置板中（in-plate）校准品，并重复（duplicate）分(fēn)析校准品和样本。校准品的范围通常比 ELISA的范围更宽，以适应各种待测物(wù)浓度，并确定每个待测物(wù)的校准曲線(xiàn)和QCs响应。值得指出，对于另一种待测物(wù)，校准曲線(xiàn)上的锚定点可(kě)能(néng)不一样。
如果仪器在运行中失败（即，产生一个部分(fēn)运行partial run），只要相关校准品和QCs成功完成且可(kě)以接受，则仍然可(kě)以使用(yòng)已分(fēn)析样本的数据。与某些顺序测定平台（sequential platforms）相比，这不太令人担心；而在那些顺序平台上，只有(yǒu)有(yǒu)限的QCs位于相对较大量的样本之间；这样的话，就可(kě)能(néng)没有(yǒu)足够的QCs来判断许多(duō)样本分(fēn)析的结果是否有(yǒu)效。
BIAcore
该平台与RIA一样，系列式地（in series）分(fēn)析样品，并使用(yòng)微孔板加载样本。因此，有(yǒu)两种方法可(kě)以运行 BIAcore 样本分(fēn)析。与 ELISA一样，按96孔，设置校准品和QCs；或者将两个板（或更多(duō)）可(kě)以作為(wèi)一个整體(tǐ)来运行：在开始时，分(fēn)析校准品，并且在整个样本分(fēn)析中穿插几组QCs。产生部分(fēn)运行结果的原因，可(kě)能(néng)是由于仪器故障；也可(kě)能(néng)是由于未知原因导致QC失败。应根据发生的情况和时间处理(lǐ)仪器故障。在由于未知原因导致QC失败的情况下，当两组已接受的QCs之间的所有(yǒu)样本都需要重新(xīn)分(fēn)析时，可(kě)以使用(yòng)bracket approach，如表3所示。
表3. Biacore样本分(fēn)析设置
总體(tǐ)而言，如果40%或更多(duō)个QC失败，则必须重新(xīn)分(fēn)析，在可(kě)接受的最后一组QC之后的，所有(yǒu)样本。只有(yǒu)在运行开始时的一组QC都通过了的情况下，才能(néng)接受第一组样本的分(fēn)析结果。如果QC的成功和失败是零星的（sporadic），则整个样本分(fēn)析运行失败，必须进行原因调查。RIA使用(yòng)类似的方法，系列式地分(fēn)析一组试管。
实施样本分(fēn)析的最佳实践
1.在方法开发的过程中，最好消除残留（carry-over），而不是在样本分(fēn)析中加以计算校正。
2.对于每个平台，应使用(yòng)短期稳定性数据来确定每次运行的持续时间，以确保样本稳定性。
3.一个分(fēn)析运行不限于96个数据点（校准品加样本）；例如，对于基于不同硬件支持，如CD和/或系列运行[run in series]，如RIA，BIAcore，Erenna®，和 Gyrolab的平台。
4.在分(fēn)析运行开始时，首先分(fēn)析标（校）准曲線(xiàn)；之后，以合理(lǐ)的频率在运行中间隔地分(fēn)析QCs，以验证该分(fēn)析平台上的结果。取决于如何定义一个分(fēn)析运行，可(kě)以在每个固體(tǐ)支持（solid support）上设置校准品，也可(kě)以设置在一个微孔板/CD上；之后是QCs间隔的一系列样本。无论一个分(fēn)析运行是如何定义的，应当有(yǒu)规律地多(duō)次分(fēn)析QCs，以确认运行内的精密度。
5.只要在方法验证期间确定的%CV在可(kě)接受的范围内，例如，小(xiǎo)于或等于目前能(néng)够接受的15%（对小(xiǎo)分(fēn)子而言），则可(kě)以进行单个样品分(fēn)析，并采用(yòng)最严格的接受标准。如果运行超过多(duō)个固體(tǐ)支持，则%CV标准指的是重复（duplicate）运行的QCs，和包括多(duō)个固體(tǐ)支持的运行内精密度。
6.对于方法转移，在更改分(fēn)析方法的平台或格式时，大多(duō)数平台需要重新(xīn)验证；即便是部分(fēn)验证也可(kě)能(néng)错过对一些关键参数的评估。因此，建议对样本分(fēn)析方法进行完整的重新(xīn)验证。
7.Multiplexing：建议尽可(kě)能(néng)在待测物(wù)的混合物(wù)中，验证每一个待测物(wù)。在样本分(fēn)析期间，如果一个待测物(wù)的分(fēn)析失败，则应重新(xīn)分(fēn)析所有(yǒu)样本，并屏蔽先前合格待测物(wù)的分(fēn)析结果。
总结与前瞻
总之，大多(duō)数药物(wù)发现阶段的PK/PD免疫分(fēn)析可(kě)以在MSD或Gyrolab平台上进行。Gyrolab还具有(yǒu)运行时间短，样本體(tǐ)积小(xiǎo)和自动化，等附加优势，因此对临床前生物(wù)分(fēn)析极具吸引力。无论分(fēn)析平台如何，本文(wén)强烈建议，在最终所需分(fēn)析方法的同一平台上，筛选试剂和评估方法的性能(néng)。在另一方面，超高灵敏度和multiplexing平台是特殊的应用(yòng)平台，通常不能(néng)对试剂进行高通量筛选。因此，可(kě)以首先在ELISA，MSD，Gyrolab或BIAcore（SPR技术）平台上对试剂进行筛选，然后在相关特殊平台上优化并最终建立相关方法。Simoa™平台因其超高灵敏度（可(kě)以使用(yòng)微量样本體(tǐ)积）和自动化操作，在相当的程度上可(kě)以替代Gyrolab平台，用(yòng)于临床前PK样本分(fēn)析。
针对可(kě)溶性靶标的新(xīn)药项目，需要在方法开发的开始，就利用(yòng)BIAcore平台使用(yòng)的SPR技术来克服耐受性（tolerance）问题。选择分(fēn)析平台时，应当牢记最终目标。虽然获得完美的方法参数是最理(lǐ)想的，但就检测方法的局限性和项目需求而言，需要切合实际；因此，需要有(yǒu)愿意在使用(yòng)的样本體(tǐ)积或分(fēn)析运行的时间，等参数上，做出妥协，以满足整體(tǐ)需求。与项目团队良好的沟通有(yǒu)助于确定相关工作的优先级别，满足对分(fēn)析方法的需求并满足相关时间表。当项目的目标预期发生变化时，需要对分(fēn)析方法的格式保持足够的灵活性，以便在不同的分(fēn)析平台之间，轻松地转移分(fēn)析方法。
每个平台在检测试剂，如Sulfo-tag、horseradish peroxidase（HRP或其他(tā)酶）方面，差异最大。因此，试剂的生物(wù)素化（biotinylation），当与各自对应的链球菌蛋白标记的试剂（streptavidin-tagged reagents）一起使用(yòng)时，可(kě)以实现分(fēn)析方法在这些平台之间的无缝转移。在需要将捕获试剂生物(wù)素化的平台（Gyrolab）上，这些生物(wù)素化的试剂可(kě)以作為(wèi)捕获（capture）使用(yòng)。无论是分(fēn)析针对可(kě)溶性靶标的药物(wù)的游离的，还是结合的百分(fēn)比，或是分(fēn)析复杂分(fēn)子的分(fēn)子完整性，都应当利用(yòng)免疫测试方法的多(duō)功能(néng)性（versatility），并相应地考虑合适的分(fēn)析平台。虽然免疫分(fēn)析领域正在迅速发展，但LC-MS等正交性生物(wù)分(fēn)析平台也在平行地发展，有(yǒu)时可(kě)以作為(wèi)免疫分(fēn)析方法的补充。因此，充分(fēn)了解正交分(fēn)析平台，并及时向这些平台的团队提示研究方向，将有(yǒu)助于项目的成功。后续文(wén)章将介绍相关进展，敬请关注。
特别声明
本文(wén)如有(yǒu)疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者评论和指正。所有(yǒu)引用(yòng)的原始信息和资料均来自已经发表學(xué)术期刊、官方网络报道等公开渠道, 不涉及任何保密信息。 参考文(wén)献的选择考虑到多(duō)样化但也不可(kě)能(néng)完备。欢迎读者提供有(yǒu)价值的文(wén)献及其评估。
参 考 文(wén) 献
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